Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

Summary

Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l'induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Abstract

Afin d'enquêter sur les événements de conduite développement du cœur et de déterminer les mécanismes moléculaires conduisant à des maladies du myocarde chez l'homme, il est essentiel d'abord de générer des cardiomyocytes humains fonctionnels (CMS). L'utilisation de ces cellules dans la découverte de médicaments et les études de toxicologie serait également très bénéfique, en permettant de nouvelles molécules pharmacologiques pour le traitement des troubles cardiaques être validées au stade clinique sur les cellules d'origine humaine. Parmi les sources possibles de la CMS, les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont parmi les plus prometteurs, car ils peuvent être directement dérivées de tissus du patient facilement accessibles et possèdent une capacité intrinsèque pour donner naissance à tous les types cellulaires de l'organisme ^1. Plusieurs méthodes ont été proposées pour la différenciation des cellules iPS en GC, allant des classiques des corps embryoïdes (EBS) approche agrégation des protocoles définis chimiquement ^2,3. Dans cet article, nous proposons un protocole EBS-base et montrons comment cette méthoD peut être utilisé pour générer efficacement des cellules CM-comme fonctionnels à partir de cellules iPS sans chargeur.

Introduction

Historiquement, l'étude des mécanismes génétiques et moléculaires de conduire le développement humain et la maladie a été basée sur la production de modèles de recherche génétiquement modifiés. Cependant, de nombreux phénotypes humains ne parviennent pas à être reproduit avec succès chez la souris, principalement en raison des différences biologiques existant entre les deux espèces. D'autre part, l'accès aux tissus humains peuvent être limitées et souvent ne permettent pas suffisamment de matière pour être obtenue pour des études expérimentales en profondeur. Le domaine de la biologie cardiovasculaire souffre de ces deux limites: la physiologie du cœur de l'homme est nettement différente de celle de la souris, et une quantité importante de tissu cardiaque est uniquement accessible post-mortem ou pendant la chirurgie cardiaque. Trouver une source optimale pour la différenciation fonctionnelle de CMS Human est donc devenue un sujet central en biologie cardiovasculaire, et beaucoup d'efforts ont été faits pour résoudre ce problème. Différents types de cellules ont été proposées, including myoblastes squelettiques, cellules cardiaques locaux souches de moelle osseuse, des cellules mononucléaires, des progéniteurs endothéliales et les cellules souches mésenchymateuses. Toutefois, les données obtenues en utilisant ces cellules n'ont pas été conforme ^4.

La dérivation de cellules souches embryonnaires humaines (ESC) ⁵ et la découverte révolutionnaire de cellules induites souches pluripotentes (iPS) par Yamanaka et Thomson ^6,7 semblé première tard pour apporter des solutions: ces cellules ont la capacité de croître indéfiniment et le potentiel de donner augmenter à tous les dérivés de cellules des trois feuillets embryonnaires, dont les GC. L'utilisation de cellules iPS offre d'autres avantages: être dérivées de cellules autologues adultes, ils portent le même génome que l'individu ou le patient dont ils sont issus. Ils permettent donc le développement de modèles in vitro qui facilitent la recherche sur les maladies et les mécanismes de développement génétiques humaines. En vertu de cette caractéristique, les cellules iPS peuvent également overcome problèmes liés au rejet immunitaire et les questions éthiques ^8. Pour ces raisons, même si les CES représentent toujours l'étalon-or dans le domaine de la biologie des cellules souches, les chercheurs du monde entier sont en train de passer plus vers la technologie des cellules iPS.

Les cellules iPS sont maintenant utilisés pour modéliser les maladies humaines in vitro pour diverses conditions, y compris les troubles cardio-vasculaires congénitales ^9,10. Récemment, l'application de la modélisation des maladies des cellules iPS a été effectuée pour des troubles cardiaques monogéniques (par exemple syndrome du QT long, catecholaminergic tachycardie ventriculaire polymorphe) et les pathologies dans lesquelles les malformations cardiaques font partie d'un phénotype complexe (ie Leopard et Timothy syndromes, cardiomyopathie dilatée). Ces rapports ont confirmé que les cellules iPS spécifiques au patient qui se différencient en GC présentent des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles similaires à celles de la maladie in vivo.

Cependant, ilya encore de nombreux défis pour améliorer l'efficacité de l'induction des cellules iPS dans la lignée cardiaque. La génération spontanée de la CMS à partir de CSE humaines par la formation d'agrégats appelé corps embryoïdes (EBS) ont fait leurs preuves ^17. Depuis cette découverte, de nombreuses autres méthodes ont été proposées. De nombreux groupes ont grandement amélioré l'efficacité du protocole de différenciation et se sont déplacés vers les réactifs de culture chimiquement définis et animale produits frais (voir Mummery, C., et al., De la recherche de Circulation (2012) pour un examen complet de toutes les méthodes ³ existants ).

Néanmoins, la méthode classique basée sur EB agrégation représente toujours le plus couramment utilisé pour réaliser des études fonctionnelles et d'enquêter sur les mécanismes de la maladie. Notre protocole proposé est fondé sur l'agrégation des cellules iPS dans EBS et de la culture en présence d'acide ascorbique et de sérum, qui a été montré pour améliorer le processus de différenciation cardiaque et de poincidence sitively la maturation de ces cellules ^18,19. Dans cet article, nous allons passer par cette méthode en détail et nous allons montrer comment utiliser des lignées de cellules iPS chargeur sans pour générer spécifique au patient CM iPS dérivées.

Protocol

1. Entretien chargeur et sans repiquage des iPS humaines lignées cellulaires Préparer les plats Matrigel revêtus. Décongeler une fiole de Matrix ESC qualifié humaine sur la glace pendant une heure et diluer dans 25 ml de milieu DMEM-F12. Ajouter 1 ml de chaque plaque de 35 mm (ou des quantités équivalentes par unité de surface si d'autres plats sont utilisés), tout garder sur la glace et faire en sorte que toutes les plaques et tubes sont pré-refroidi. Couvrir les plaques avec du papier d'al…

Representative Results

Dans nos études, nous avons généré CM de plusieurs lignées de cellules iPS. Ces lignes ont d'abord été générées sur une couche nourricière MEF mais ont été immédiatement placés sur Matrigel utilisant un milieu défini (soit mTESR1 ou Nutristem). Différents tests ont permis de vérifier l'entretien des propriétés morphologiques, l'expression de marqueurs typiques des cellules pluripotentes (Oct-4, SSEA4 et TRA1-60) et leur stabilité du génome (Figure 1). <p class="jove…

Discussion

Les cellules souches pluripotentes ont le potentiel de se différencier spontanément en GC, mais avec une faible efficacité et une forte variabilité entre les lignes. Le développement de nouvelles méthodes d'induction a donc mis l'accent sur l'amélioration de l'efficacité du processus et se déplaçant vers des protocoles plus définis. Cependant, la plupart de ces nouvelles méthodes de différenciation sont assez complexes, nécessitant des conditions complexes de la culture, le contrôle préci…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon