인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

Summary

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

Abstract

심장 개발을 운전 사건을 조사하고, 인간의 심근 질환에 이르는 분자 메커니즘을 결정하기 위해 기능적 인간의 심근 (CMS)를 생성하는 첫 번째 필수입니다. 약물 발견 및 독성학 연구에서 이러한 세포의 사용은 또한 인간의 기원 세포 사전 임상 적 유효성을 검사 할 심장 질환의 치료를위한 새로운 약물 분자를 허용, 매우 도움이 될 것입니다. CMS를 수있는 소스, 유도 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포들이 쉽게 접근 환자의 조직에서 직접 파생 될 수있는, 가장 유망한 사이이며, 본체 ^(1)의 모든 세포 유형을 야기 할 수있는 고유의 능력을 가지고있다. 여러 가지 방법이 화학적으로 정의 된 프로토콜 ^2,3에 고전 배아 체에서 (사채) 집계 방식에 이르기까지, CM을에 IPS 세포 차별화를 위해 제안되었다. 이 문서에서 우리는 사채 기반 프로토콜을 제안하고 보여주는 방법이 METHOD를 효율적으로 장치가없는 IPS 세포의 기능 CM과 같은 세포를 생성하기 위해 사용 할 수 있습니다.

Introduction

역사적으로, 인간 발달과 질병을 운전 유전 및 분자 메커니즘 연구는 유전자 변형 동물 모델의 생성에 기초하고있다. 그러나 수많은 인간의 표현형이 성공적으로 주로하기 때문에 두 종족 사이에 존재하는 생물학적 차이, 생쥐 복제에 실패합니다. 반면에, 인간의 조직에 대한 액세스를 제한 할 수 있으며, 자주 자료가 심도있는 실험 연구를 취득 할 수 없습니다. 심장 혈관 생물학 분야는 이러한 제한을 모두 앓고 : 인간의 마음의 생리는 마우스의 그것과 크게 다르고, 심장 조직의 상당한 수량은 사후 또는 심장 수술 동안 액세스 할 수 있습니다. 기능 인간의 CMS 분화 최적의 소스를 찾기 때문에 심장 혈관 생물학의 중심 화제가되고 있으며, 많은 노력이 문제를 해결하기 위해 만들어졌다. 다양한 세포 유형은 내가 제안되었다ncluding 골격 근모, 지역 심장 줄기 세포, 골수 단핵 세포, 내피 전구 세포와 중간 엽 줄기 세포. 그러나 데이터는 ⁴ 일치되지 않은 이러한 세포를 사용하여 얻었다.

인간 배아 줄기 세포 (ESC)의 유도는 처음 ⁵ 야마나카와 톰슨 ^6,7에 의해 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포의 획기적인 발견은 나중에 솔루션을 제공 할 듯 : 이러한 세포주기 위하여 무한정 성장 능력과 잠재력을 가지고 CMS를 포함한 세 가지 배엽의 세포 파생 상품에 상승. IPS 세포의 사용이 더 장점을 제공합니다 :자가 성인 세포에서 파생 된을, 그들은이 파생되는 개인 또는 환자와 같은 게놈을 가지고 다니십시오. 그러므로 그들은 인간의 유전 질환 및 개발 메커니즘의 조사를 용이하게 체외 모델의 개발을 할 수 있습니다. 이러한 특성 덕분에, IPS 세포는 O를 할 수 있습니다면역 거부 및 윤리적 문제 ^8에 관한 vercome 문제. 줄이고 ESCs는 여전히 줄기 세포 생물학 분야의 황금 표준을 표현하더라도 이러한 이유로 들어, 연구자들은 전세계는 이제 만능 줄기 세포 기술쪽으로 더 이동하고있다.

IPS 세포는 현재 선천성 심장 질환 ^9,10 등 다양한 조건에 대한 체외에서 인간의 질병을 모델로 채택되고있다. 최근의 IPS 세포 질병 모델링 응용 프로그램은 단일 유전자 심장 질환 (즉, 긴 QT 증후군, 카테콜아민 다형성 심실 빈맥)과 심장 결함이 복잡한 표현형 (예 : 레오파드와 티모시 증후군, 확장 성 심근증)의 일부가되는 병리에 대해 수행되었다. 이 보고서는 CM을로 분화되어 환자 특정 만능 줄기 세포가 생체 내에서 질병으로 유사한 표현형과 기능적 특성을 표시 함을 확인 하였다.

그러나,심장 계통에 만능 줄기 세포를 유도 효능을 개선하기 위해 여전히 많은 도전이 있습니다. 골재 형성을 통해 인간 줄이고 ESCs에서 CMS를 자연 발생은 배아 체는 (사채) 성공 ¹⁷ 입증했다. 이 발견 이후, 많은 다른 방법이 제안되었다. 여러 그룹이 크게 분화 프로토콜의 효율성을 향상하고 (무언극을 참조 C., 외., 기존의 모든 방법 ^3의 종합적인 검토를위한 순환 연구 (2012) 화학적 및 동물 제품 무료 문화 시약쪽으로 이동 한 ).

그럼에도 불구하고, EB 집계에 따라 고전적인 방법은 여전히​​ 가장 일반적으로 기능 연구를 수행하고 질병의 메커니즘을 조사에 대한 고용을 나타냅니다. 제안 프로토콜은 심장 분화 과정을 개선하기 위해 표시되었습니다 혈청 아스 코르 빈산의 존재 사채에 IPS 세포의 집단 문화와 포에 근거sitively 이러한 세포 ^18,19의 성숙에 영향을 미칠. 이 문서에서 우리는 구체적으로이 방법을 통해 이동하고 환자 특정 IPS-파생 CM을 생성을위한 장치가없는 만능 줄기 세포 라인을 사용하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

1. 인간의 IPS 세포 라인 피더 무료 유지 보수 및과 Passaging 마트 리젤 코팅 접시를 준비합니다. 해동 한 한 시간 얼음에 인간의 ESC 자격을 갖춘 매트릭스의 유리 병 25 ML DMEM-F12 배지에 희석. 얼음에 모든 것을 유지하고 모든 접시와 튜브 사전 냉각되도록 각 35mm 플레이트 (또는 다른 접시를 사용할 경우 면적 당 상응하는 금액)에 1 ML을 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 커버. <p class…

Representative Results

우리의 연구에서 우리는 몇 가지 만능 줄기 세포 라인에서 CM을 생성. 이 라인은 처음 MEF 피더 레이어에서 생성되었지만 바로 정의 매체 (mTESR1 또는 Nutristem 중 하나)을 사용하여 리겔에 배치했다. 다양한 분석은 형태 학적 특성, 만능 세포의 일반적인 마커의 발현 (10 월 4 SSEA4 및 TRA1-60)과 유전체의 안정성 (그림 1)의 유지를 확인하는 데 사용되었다. 심장 계통에 유…

Discussion

pluripotent 줄기 세포 라인 사이에 낮은 효율과 높은 변동성이기는하지만, CM을에 자발적으로 분화 할 수있는 잠재력이있다. 새로운 유도 방법의 개발은 따라서 프로세스의 효율성을 개선하고 더 많은 정의 된 프로토콜을 향해 이동에 초점을 맞추고있다. 그러나, 이러한 새로운 차별화 방법의 대부분은 정교한 배양 조건, 타이밍 및 시약의 농도의 미세 조정, 고가의 사이토 카인과 성장 인자 치료를 …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon