Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Summary

Intercellulaire Ca^{2 +}-Golven worden gedreven door gap junctie kanalen als hemikanalen. Hier beschrijven we een methode om intracellulaire Ca meten^{2 +}-Golven in celmonolagen in reactie op een lokale eencellige mechanische stimulus en de toepassing ervan op de eigenschappen en de regulering van de gap junction kanalen en hemikanalen onderzoeken.

Abstract

Intercellulaire communicatie is essentieel voor de coördinatie van fysiologische processen tussen cellen in diverse organen en weefsels zoals de hersenen, lever, retina, cochlea en vaatstelsel. In experimentele opstellingen, intracellulaire ^{Ca2 +-golven} worden opgewekt door een mechanische prikkel een enkele cel. Dit leidt tot de afgifte van de intracellulaire signalerende moleculen _IP3 pt ^{Ca2 +} die de voortplanting van de Ca ^{2 +-golf} inleiding concentrisch van de mechanisch gestimuleerde cel om de naburige cellen. De belangrijkste moleculaire pathways die intercellulaire ^{Ca2 +-golven} controle worden geleverd door gap junction kanalen via de rechtstreekse overdracht van _IP-3 en door hemikanalen door het vrijkomen van ATP. Identificatie en karakterisering van de eigenschappen en de regelgeving van de diverse connexin en pannexin isovormen als gap junction kanalen en hemikanalen zijn toegestaan ​​door de quantification van de verspreiding van de intercellulaire Ca ^{2 +-golf,} siRNA, en het gebruik van remmers van gap junction kanalen en hemikanalen. Hier beschrijven we een methode om intracellulaire ^{Ca2 +-golf} in monolagen van primaire corneale endotheliale cellen met Fluo4-vm in antwoord op een gecontroleerde en gelokaliseerde mechanische stimulus veroorzaakt door een acuut en kortdurend vervorming van de cel te meten als gevolg het aanraken van de celmembraan met een micromanipulator gecontroleerde glazen micropipet met een tip diameter van minder dan 1 urn. Ook beschrijven de isolatie van primaire boviene corneale endotheelcellen en het gebruik ervan als modelsysteem voor Cx43 hemichannel activiteit uitoefent als de aangedreven kracht intracellulaire Ca ^{2 +-golven} door het vrijkomen van ATP. Tenslotte bespreken we het gebruik, voordelen, beperkingen en alternatieven van deze werkwijze in het kader van gap junction kanaal en hemichannel onderzoek.

Introduction

Intercellulaire communicatie en signalering zijn essentieel voor de coördinatie van fysiologische processen in reactie op extracellulaire agonisten op weefsel en hele-orgaan level ^1,2. De meest directe manier intercellulaire communicatie wordt door het optreden van gap junctions. Gap junctions zijn plaquettes van gap junction kanalen, die eiwitachtige kanalen gevormd door de head-to-head couperen van twee connexine (Cx) hemichannels van aangrenzende cellen ^3,4 (figuur 1) zijn. Gap junctions doorlaten kleine signaalmoleculen met een molecuulgewicht van minder dan 1,5 kDa, zoals ^{Ca2 +} of IP ₃ ^5, waardoor modulerende ^{Ca2 +-afgifte} uit de intracellulaire opslagplaatsen van de naburige cellen ⁶ (figuur 2). Gap junction kanalen zijn strak gereguleerd door intra-en intermoleculaire eiwit interacties en door cellulaire signalering processen, zoals redox wijziging enfosforylering ^7. GJS vergemakkelijken de gecoördineerde respons van de aangesloten cellen, waardoor die als een chemische en elektrische syncytium. Bijvoorbeeld, de verspreiding van cardiale actiepotentiaal in de atriale en ventriculaire myocyten wordt gemedieerd door Cx-based GJ kanalen ^85. Cxs niet alleen een rol van gap junction kanalen, maar ook vormen ongepaarde hemichannels, daardoor functioneren als kanalen in membranen eveneens regelmatig ionenkanalen ^8-10 (Figuur 1). Hemichannels deelnemen aan paracrienen tussen naburige cellen door het regelen van de uitwisseling van ionen en signaalmoleculen tussen de intra-en extracellulaire milieu.

In veel celtypen (zoals epitheelcellen, osteoblasten, astrocyten, endotheelcellen, enz.) en organen (zoals de hersenen, de lever, de retina, cochlea en het vaatstelsel), intercellulaire ^{Ca2 +-golven} zijn fundamenteel voor de coördinatie van meercellige reacties <sup> 11. Verhogingen van de intracellulaire ^{Ca2 +} niveaus in een bepaalde cel zijn niet beperkt tot deze cel, maar doorgeven aan de omringende naburige cellen is, zodat de intracellulaire Ca ^{2 +-wave 12,13.} Deze intercellulaire ^{Ca2 +-golven} zijn belangrijk voor de normale fysiologische regulering cellagen als syncytia en de dysregulatie is geassocieerd met pathofysiologische processen ^11. In de hoornvliesendotheel en epitheel, verschillende groepen ^14-24, inclusief onze eigen ^25-33, bestudeerde de mechanismen en de rol van intercellulaire communicatie. In niet-exciteerbare cellen, zoals corneale endotheelcellen, twee verschillende modi van intercellulaire communicatie plaatsvinden ^28,29, namelijk spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracriene intercellulaire communicatie. Spleetovergangen intercellulaire communicatie impliceert een directe uitwisseling van signaalmoleculen via gap junctions ^7. Gap juncnale intercellulaire communicatie is van cruciaal belang voor het behoud van weefsel homeostase, het regelen van celproliferatie, en de oprichting van een gesynchroniseerde reactie op extracellulaire spanning ^10,34,35. In een aantal pathologieën, wordt gap junction koppeling verminderd als gevolg van gebrekkige Cxs, en hierbij van invloed spleetovergangen intercellulaire communicatie ^36. Dit benadrukt het belang en de invloed van spleetovergangen intercellulaire communicatie in meercellige organismen. In tegenstelling tot spleetovergangen intercellulaire communicatie paracriene intercellulaire communicatie is niet afhankelijk van cel-cel bijstelling, omdat impliceert de diffundeerbare extracellulaire messengers (figuur 2). Verschillende soorten signaalmoleculen worden uitgebracht in de extracellulaire ruimte door signalering cellen. Het molecuul wordt dan naar de doelcel, waar het wordt gedetecteerd door een specifiek receptoreiwit. Vervolgens wordt het receptor-complex signaal induceert een cellulaire reactie diewordt beëindigd door verwijdering van het signaal, inactivering of desensibilisatie. Uitgebracht lipofiele extracellulaire signalen boodschappers penetreren het membraan en handelen op intracellulaire receptoren. Daarentegen hebben hydrofiele boodschappers niet over de plasmamembraan van de reagerende cel, maar fungeren als een ligand dat bindt aan het oppervlak tot expressie gebrachte receptor eiwitten, die doorzenden het signaal naar de intracellulaire omgeving. Drie belangrijke families van celoppervlak receptor-eiwitten aan dit proces: ionkanaal-gekoppelde, enzyme-linked, en G eiwit-gekoppelde. De vrijgegeven boodschappermolecule kan handelen receptoren van dezelfde cel (autocriene) op doelwitcellen in de nabijheid (paracriene) of op verre doelcellen die de bloedsomloop (endocriene) vereist.

In vele celtypen, waaronder corneale endotheel ^28,29, ATP is een van de belangrijkste hydrofiele, paracriene factoren die de voortplanting van intracellulaire ^{Ca2 +-golven 37-40} drijven. During mechanische vervorming, hypoxie, ontsteking of stimulatie door verschillende agenten, kan ATP uit gezonde cellen ^41-44 worden uitgebracht in reactie op shear stress, rek, of osmotische zwelling ^44,45. Verschillende ATP-afgifte mechanismen geopperd, zoals vesiculaire exocytose ⁴⁴ en een veelheid van transportmechanismen, zoals ATP-bindende cassette (ABC) transporters, plasmalemmal spanningsafhankelijke anion kanalen ^46, P2X7 receptor kanalen ^47,48, alsmede connexin hemichannels ^49-52 en pannexin hemikanalen ^43,49,53. Extracellulair ATP kan snel gehydrolyseerd ADP, AMP en adenosine ^54,55 door ectonucleotidases die in het extracellulaire milieu. Het extracellulair vrijgegeven ATP en zijn metaboliet ADP ⁵⁶ zal verspreiden via diffusie. De daaropvolgende interactie van deze nucleotiden purinerge receptoren in de naburige cellen is betrokken bij de propagation van intercellulaire ^{Ca2 +-golven 28,37,51.} Twee verschillende klassen van purinerge receptoren aanwezig zijn: adenosine is de voornaamste natuurlijke ligand voor P1-purinoceptoren, terwijl zowel purine (ATP, ADP) en pyrimidine (UTP, UDP) nucleotiden handelen meeste P2-purinoreceptoren ^57.

Intercellulaire communicatie kan worden onderzocht door verschillende methoden, zoals schrapen loading, kleurstofoverdracht, lokale uncaging van agonisten zoals _IP3 en Ca ^{2 +,} mechanische stimulatie enz.. Hier beschrijven we de studie van Ca ^{2 +-golven} opgewekt door mechanische stimulatie van een enkele cel. Het voordeel van het bestuderen van Ca ^{2 +-golven} door mechanische stimulatie is dat het een eenvoudig hulpmiddel om de verspreiding van de Ca ^{2 +-golf} in de tijd te kwantificeren en geeft kwantitatief vergelijken van verschillende voorbehandelingen van de cellen. In het corneale endothelium, die intracellulaire Ca ^{2 +-golven} kunnen een cogecoördineerd antwoord van de monolaag, wordt als een mogelijke afweermechanisme van de niet-regeneratieve corneale endotheel helpen het endotheel aan extracellulaire spanningen tijdens intraoculaire chirurgie weerstaan, of na blootstelling aan ontstekingsmediatoren bij afstoting of uveitis ^58,59.

Protocol

1. Isolatie van corneale endotheelcellen Voordat u begint: Isoleer de cellen van de frisse ogen, verkregen uit een lokaal slachthuis, zo spoedig mogelijk na enucleating het oog. Zorg ervoor dat het oog werd enucleated uit een koe van maximaal 18 maanden oud zijn, vijf minuten post mortem en bewaard in Earle's Balanced Salt Solution – 1% jodium oplossing bij 4 ° C voor het transport naar het laboratorium. Neem het oog uit het Earle's Balanced Salt Solution – 1% jodium-oplo…

Representative Results

Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties en het protocol wordt gedemonstreerd wordt uitgevoerd onder de leiding en goedkeuring van het dier zorg en gebruik commissie van de KU Leuven. In runder corneale endotheelcellen (BCEC) worden functionele gap junctions expressie en beide spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracriene intercellulaire communicatie aanzienlijk bijdragen aan intercellulaire …

Discussion

In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige methode om intracellulaire ^{Ca2 +-golven} meten monolagen van primaire boviene corneale endotheelcellen door een lokale en gecontroleerde mechanische stimulatie met behulp van een micropipet. Mechanisch gestimuleerde cellen reageren met een lokale toename van intracellulaire _IP3 pt ^{Ca2 +,} die beide essentiële intracellulaire signalerende moleculen die rijden intracellulaire Ca ^{2 +-golven 11,67.} _IP3 wordt direct overgebr…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller