Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen

Summary

Intercellular Ca^{2 +}-Wellen werden von Gap Junction Kanälen und hemichannels angetrieben. Hier beschreiben wir eine Methode, um interzelluläre Ca messen^{2 +}-Wellen in Zellmonoschichten in Reaktion auf eine lokale Single-Cell-mechanischen Reiz und ihre Anwendung auf die Eigenschaften und Regulation von Gap Junction Kanälen und hemichannels untersuchen.

Abstract

Interzelluläre Kommunikation ist für die Koordinierung der physiologischen Prozesse zwischen Zellen in einer Vielzahl von Organen und Geweben, einschließlich des Gehirns, der Leber, der Retina, Cochlea und Gefäßsystem. In experimentellen Einstellungen interzelluläre Ca ^{2 +-Wellen} kann durch Anlegen einer mechanischen Reiz auf eine einzelne Zelle hervorgerufen werden. Dies führt zur Freisetzung der intrazellulären Signalmoleküle IP ₃ und Ca ^{2 +,} die die Ausbreitung des Ca ^{2 +-Welle} einzuleiten konzentrisch von der mechanisch stimuliert Zelle an den benachbarten Zellen. Die wichtigsten molekularen Signalwege, die intrazelluläre Ca ^{2 +-Wellenausbreitung} Kontrolle durch Gap Junction Kanälen durch die direkte Übertragung von IP ₃ und hemichannels durch die Freisetzung von ATP zur Verfügung gestellt. Identifizierung und Charakterisierung der Eigenschaften und der Regulierung der unterschiedlichen Connexin und Pannexin Isoformen als Gap Junction Kanälen und hemichannels werden vom quantificatio erlaubtn für die Ausbreitung der interzellulären Ca ^{2 +-Welle,} siRNA, und die Verwendung von Inhibitoren von Gap-junction-Kanäle und hemichannels. Hier beschreiben wir eine Methode, um intrazelluläre Ca ^{2 +-Welle} in Monoschichten von primären Endothelzellen mit Fluo4-AM in Reaktion auf eine kontrollierte und lokalisierte mechanische Reiz durch eine akute, kurz andauernde Verformung der Zelle provoziert geladen messen als Folge Berühren der Zellmembran mit einem Mikromanipulator gesteuert Glas-Mikropipette mit einem Durchmesser der Spitze von weniger als 1 um. Wir beschreiben auch die Isolierung von primären bovinen Endothelzellen und seine Verwendung als Modellsystem, um die Cx43-hemichannel Aktivität wie das angetriebene Kraft für interzelluläre Ca ^{2 +-Wellen} durch die Freisetzung von ATP zu beurteilen. Schließlich diskutieren wir den Einsatz, Vorteile, Grenzen und Alternativen dieser Methode im Rahmen der Gap Junction Kanals und hemichannel Forschung.

Introduction

Interzellulären Kommunikation und Signalisierung für die Koordinierung der physiologischen Prozesse in Reaktion auf extrazelluläre Agonisten an das Gewebe und ganzen Organniveau ^1,2 erforderlich. Der direkte Weg der interzellulären Kommunikation wird durch das Auftreten von Gap Junctions erstellt. Gap Junctions sind Plaques von Gap Junction Kanälen, die proteinhaltige Kanäle durch den Kopf-an-Kopf-Docking von zwei Connexin (Cx) hemichannels benachbarter Zellen ^3,4 (Abbildung 1) ausgebildet sind. Gap Junctions den Durchtritt von kleinen Signal-Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1,5 kDa, darunter Ca ^{2 +} oder IP ₃ ^5, verursacht und Modulieren Ca ^{2 +-Freisetzung} aus intrazellulären Speichern der von den benachbarten Zellen ⁶ (Abb. 2). Gap Junction Kanäle sind eng durch intra-und intermolekulare Protein-Interaktionen und zelluläre Signalwege reguliert Prozesse wie Redox-Modifikation undPhosphorylierung ^7. GJS erleichtern die koordinierte Antwort von verbundenen Zellen, wodurch sie als eine chemische und elektrische Synzytium. Zum Beispiel ist die Verbreitung von Herztätigkeitspotential für die atrialen und ventrikulären Myozyten durch Cx-basierte GJ Kanäle ⁸⁵ vermittelt. CXS nicht nur eine Rolle als Gap Junction Kanälen, sondern bilden auch ungepaarten hemichannels, wodurch sie als Kanäle in den Membranen ähnlich wie regelmäßige Ionenkanäle ^8-10 (Abbildung 1). Hemichannels beteiligen parakrine Signalisierung zwischen benachbarten Zellen durch die Steuerung der Austausch von Ionen und Signalmoleküle zwischen dem intra-und extrazellulären Umgebung.

In vielen Zelltypen (zB Epithelzellen, Osteoblasten, Astrocyten, Endothelzellen, etc.) und Organe (wie Gehirn-, Leber-, Retina, Cochlea und dem Gefäßsystem), intrazelluläre Ca ^{2 +-Wellen} für die Koordinierung der vielzelligen Antworten grundlegende <sup> 11. Erhöhungen der intrazellulären Ca ^{2 +-Spiegel} in einer bestimmten Zelle nicht auf diese Zelle beschränkt, sondern Propagation in die umliegenden Nachbarzellen, wodurch eine intrazelluläre Ca ^{2 +-Welle 12,13.} Diese intrazellulären Ca ^{2 +-Wellen} sind für den normalen physiologischen Regulation von Zell-Schichten als Synzytium und deren Fehlregulation hat mit pathophysiologischen Prozessen ¹¹ in Verbindung gebracht wichtig. Im Hornhautendothel und Epithel, studierte verschiedene Gruppen ^{14-24, 25-33} einschließlich unserer eigenen, die Mechanismen und die Rolle der interzellulären Kommunikation. In nicht-erregbaren Zellen, wie Endothelzellen, treten zwei unterschiedliche Modi der interzellulären Kommunikation ^28,29, nämlich interzellulären Gap Junction-Kommunikation und parakrine interzelluläre Kommunikation. Interzellulären Gap Junction-Kommunikation beinhaltet einen direkten Austausch von Signalmolekülen über Gap Junctions ^7. Gap junclen interzelluläre Kommunikation ist entscheidend für die Aufrechterhaltung Gewebshomöostase, Controlling Zellproliferation, und zur Errichtung einer synchronisierten Reaktion auf extrazelluläre Stress ^10,34,35. In einer Reihe von Krankheiten, ist Gap Junction Kopplung aufgrund defekter CXS reduziert und hierdurch beeinträchtigt interzellulären Gap Junction-Kommunikation ^36. Dies unterstreicht die Bedeutung und den Einfluss der interzellulären Gap Junction-Kommunikation in mehrzelligen Organismen. Im Gegensatz zu interzellulären Gap Junction-Kommunikation ist parakrine interzelluläre Kommunikation nicht abhängig von Zell-Zell-Apposition, da es die Freisetzung von diffusible extrazelluläre Botenstoffe (Abbildung 2) beinhaltet. Verschiedene Arten von Signalmolekülen in den extrazellulären Raum durch Signalisierung Zellen freigesetzt wird. Das Molekül wird dann an die Zielzelle, wo es von einem spezifischen Rezeptor Protein nachgewiesen transportiert. Anschließend wird der Rezeptor-Komplex Signal induziert eine zelluläre Antwort, dieBei Entfernung des Signals, Inaktivierung oder Desensibilisierung beendet. Veröffentlicht lipophilen extrazellulären Signalisierung Boten in die Membran eindringen und wirken auf intrazelluläre Rezeptoren. Im Gegensatz dazu hydrophilen Boten nicht über die Plasmamembran der Zelle reagiert, sondern wirken als Liganden, der an der Oberfläche exprimiert Rezeptorproteine, die dann das Relais das Signal an die intrazelluläre Umgebung bindet. Drei große Familien von Zelloberflächen-Rezeptor-Proteine ​​in diesem Prozess zu beteiligen: Ionenkanal-vernetzt, enzyme-linked und G-Protein-gekoppelt. Das freigesetzte Botenstoff kann auf Rezeptoren der gleichen Zelle (autokrine) handeln, auf Zielzellen in unmittelbarer Nähe (parakrine) oder auf entfernten Zielzellen, die das Kreislaufsystem (endokrine) erfordern.

In vielen Zelltypen, einschließlich Endothel ^28,29 ATP ist eine der wichtigsten hydrophilen, parakrine Faktoren, die die Ausbreitung der interzellulären Ca ^{2 +-Wellen 37-40} anzutreiben. During mechanische Verformung, Hypoxie, Entzündung oder Stimulation durch verschiedene Mittel, kann ATP von gesunden Zellen in Reaktion auf ^41-44 Schubspannung, Stretch oder osmotische Schwellung ^44,45 freigegeben werden. Verschiedene ATP-Freisetzung Mechanismen postuliert worden, darunter vesikulären Exozytose ⁴⁴ und einer Vielzahl von Transport-Mechanismen, wie ATP-binding cassette (ABC) Transporter, plasmalemmalen spannungsabhängigen Anionen-Kanäle ^46, P2X7-Rezeptor-Kanäle ^47,48, sowie Connexin hemichannels ^49-52 und Pannexin hemichannels ^43,49,53. Extrazelluläre ATP kann schnell hydrolysiert, ADP, AMP und Adenosin ^54,55 durch ectonucleotidases, die in der extrazellulären Umgebung sind. Die extrazellulär freigesetzt ATP und sein Metabolit ADP ⁵⁶ wird durch Diffusion verbreiten. Die anschließende Wechselwirkung mit dieser Nukleotide Adenosin-Rezeptoren in den benachbarten Zellen in der p verwickeltropagation der interzellulären Ca ^{2 +-Wellen 28,37,51.} Zwei Klassen von Adenosin-Rezeptoren sind: Adenosin ist die wichtigste natürliche Ligand für P1-Purinozeptoren, während sowohl purin (ATP, ADP) und pyrimidin (UTP, UDP) Nucleotide am P2-Purinozeptoren ⁵⁷ handeln.

Interzelluläre Kommunikation kann durch verschiedene Methoden, wie Scrape Loading, Farbstoffübertragung lokalen Uncaging von Agonisten wie IP ₃ und Ca ^{2 +,} mechanische Stimulation etc. untersucht werden. Hier beschreiben wir die Studie von Ca ^{2 +-Wellenausbreitung} durch mechanische Stimulation von einer einzigen Zelle ausgelöst. Der Vorteil des Studiums Ca ^{2 +-Wellenausbreitung} durch mechanische Stimulation ist, dass es ein einfaches Werkzeug ermöglicht, um die Ausbreitung des Ca ^{2 +-Welle} im Laufe der Zeit zu quantifizieren und ermöglicht quantitativen Vergleich verschiedener Vorbehandlungen der Zellen. In dem Endothel, diese interzelluläre Ca ^{2 +-Wellen} erlauben coabgestimmte Antwort der Monoschicht, wird als eine mögliche Abwehrmechanismus des nicht regenerativen Hornhautendothel hilft das Endothel der extrazellulären Spannungen während einer intraokularen Operation zu widerstehen, oder unter Einwirkung von Entzündungsmediatoren während Immunabwehr oder Uveitis ^58,59.

Protocol

1. Isolierung von Endothelzellen Bevor Sie beginnen: Isolieren Sie die Zellen aus den frischen Augen, von einem lokalen Schlachthof, so bald wie möglich nach enucleating das Auge erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Auge von einer Kuh von maximal 18 Monate alt, nur fünf Minuten post mortem und konserviert in Balanced Salt Solution Earle wurde entkernt – 1% Jod-Lösung bei 4 ° C für den Transport zum Labor. Nehmen Sie das Auge aus der Balanced Salt Solution Earle – 1% Jod-Lö…

Representative Results

Alle Versuche werden unter Einhaltung aller einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden ausgeführt und das Protokoll die demonstriert wird, unter der Leitung und Genehmigung der Tierpflege und Nutzung Ausschuss der KU Leuven durchgeführt. In Rinder-Endothelzellen (BCEC) werden funktionelle Gap Junctions ausgedrückt und beide interzellulären Gap Junction-Kommunikation und parakrine interzelluläre Kommunikation wesentlich zur interzellulären Kommunikation in einer int…

Discussion

In diesem Manuskript, beschreiben wir eine einfache Methode, um intrazelluläre Ca ^{2 +-Wellenausbreitung} in Monoschichten von primären bovinen Endothelzellen zu messen, indem sie eine lokalisierte und kontrollierte mechanische Stimulation mit einer Mikropipette. Mechanisch stimulierten Zellen mit einer lokalen Erhöhung der intrazellulären IP ₃ und Ca ^{2 +} reagieren, die beide wesentliche intrazelluläre Signalmoleküle, die eine intrazelluläre Ca ^{2 +-Wellenausbreitung 11,67}…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller