Summary
Vi beskriver en metod för att skapa en tillförlitlig modell för cerebral venös hypertension hos den vuxna musen. Denna modell har allmänt beskrivits och testades på råtta. Denna nya motsvarighet i möss öppnar möjligheten att använda genetiska modifierade djur och därigenom breddar tillämpningar av modellen.
Abstract
Förståelsen för patofysiologin av hjärnkärlmissbildningar och arteriovenösa fistlar har förbättrats tack vare djurmodeller. En råttmodell skapa en artificiell fistel mellan den gemensamma halsartären (CCA) och den externa halsvenen (EJV) har allmänt beskrivits och visat sig vara tekniskt möjligt. Denna konstruktion framkallar en konsekvent cerebral venös hypertension (CVH), och därför har hjälpt studera bidrag venös hypertension till bildning, kliniska symptom, och prognos av hjärn AVM och durala AVFs. Motsvarande möss modeller har endast knappt beskrivits och har visat problem med stenos i fisteln. En etablerad musmodell skulle tillåta att studera inte bara patofysiologi utan också potentiella genetiska terapier för dessa cerebrovaskulära sjukdomar.
Vi presenterar en modell av arteriovenös fistel som producerar en tålig intrakraniell venös hypertension i mus. Mikro anastomos of murina CCA och EJV kan vara svårt på grund av diminutiv anatomi och ofta resultera i en icke-patent fistel. I detta steg-för-steg-protokollet vi itu med alla de viktiga utmaningar som uppstår under den här proceduren. Undvika överdriven indragning av venen under exponeringen, med hjälp 11-0 suturer istället för 10-0, och göra en noggrant planerad end-to-side anastomos är några av de kritiska stegen. Även om denna metod kräver avancerade mikro kunskaper och en längre inlärningskurva som motsvarigheten i råtta, det kan konsekvent utvecklat.
Denna roman Modellen har utformats för att integrera transgena möss tekniker med en tidigare väletablerat experimentella system som har visat sig användbara för att studera hjärnan AVM och durala AVFs. Genom att öppna möjligheten att använda transgena möss, kan uppnås ett bredare spektrum av godkända modeller och genetiska behandlingar kan också testas. Den experimentella konstruktionen skulle också kunna vidare anpassad till studiet av othennes cerebrovaskulära sjukdomar relaterade med venös hypertension såsom migrän, transitorisk global amnesi, gående lupp blindhet, etc.
Introduction
Djurmodeller av cerebral venös hypertension har visat sig vara ett viktigt verktyg i förståelsen av patofysiologin av hjärnkärlmissbildningar och arteriovenösa fistlar 1-7. Den mest använda är råttmodellen skapas genom en artificiell fistel mellan den gemensamma halsartären (CCA) och den externa halsvenen (EJV), vilket framkallar en konsekvent cerebral venös hypertoni (CVH) i råtta 1,8-10. Likvärdiga möss modeller, genom att öppna möjligheten att använda olika transgena möss stammar, skulle möjliggöra ytterligare studie om inte bara patofysiologi utan också potentiella genetiska terapier för dessa cerebrovaskulära sjukdomar. Vidare, den experimentella konstruktionen skulle också kunna vidare anpassad till studiet av andra cerebrovaskulära sjukdomar relaterade med venös hypertoni såsom migrän, transitorisk global amnesi, transitorisk monokulär blindhet, etc. 11 Emellertid, tidigare försök att konstruera dessa musmodeller have visat svårigheterna med öppenhet för fisteln på grund av den diminutiva anatomi 5,12. Här beskriver vi vår steg-för-steg-protokoll för en framgångsrik anastomos av den murina CCA och EJV som översätter till en långsiktiga patent fistel och en varaktig venös hypertoni i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Mouse
- Framkalla narkos i mus med isofluran gas. Injicera 0,15 ml av intraperitoneal brupenorphine för smärtlindring. Innan du fortsätter, kontrollera om anestesinivån är tillfredsställande genom att sticka musens tassar.
- Placera musen i rygg VILA med de fyra lemmarna fastställts av tejp. Avlägsna håret av halsen och den övre bröstkorgen med en sax. Via subkutan injektion, administrera 0,2-0,4 ml av 0,9% saltlösning för att hålla musen hydratiseras under den kirurgiska proceduren.
- Förbered operationsområdet efter ett strikt steril metod. Bör rengöras Det område av huden snitt med 90% alkohol.
2. Analysera den gemensamma halspulsådern och extern halsvenen
- Gör ett horisontellt mittlinjen cervikal incision över den lägre halsområde av musen. Efter fördjupa såret, höja spottkörtlarna och livmoderhalscancer mjukvävnad genom att använda viddiffraktion sutur (Figur 1). Exponera rätt extern halsvenen (EJV) lateralt sternocleidomastoideus (SCM). Detta steg bör utföras under mikroskop, eftersom överdriven dragkraft över venen kan skada den och inducera sin trombos.
- Försiktigt dissekera rätt EJV längs dess kurs från nyckelbenet till skallbasen. Vanligtvis elektriska bipolära pincett, koagulerar och dela eventuella grenar för att förbereda en lämplig längd för senare tillfällig klippet placering och anastomos.
- Lateral till luftstrupen och mediala till SCM, utforska gemensamma halspulsådern (CCA). Det bör noga exponeras från nyckelbenet till strax bortom dess förgrening i de yttre och inre halspulsåder. Under detta steg bör uppmärksammas igen för att undvika överdriven dragkraft till EJV som senare skulle kunna äventyra öppenheten hos anastomosen.
3. Förbereda Anastomos
- Ligate CCA med 10-0 Nylon alldeles proximalt till dess bifurkation. Applicera därefter ett tillfälligt klipp över proximala CCA så nära nyckelbenet som möjligt.
- När flödet har avbrutits, transekt artären strax under bifurkationen ligatur och vattna den med koksaltlösning för att tvätta bort eventuella kvarvarande blod inne i lumen. Undvik bipolär koagulation i detta steg, eftersom värmeskada till artärväggen kunde sätta den framtida anastomos i fara.
- För att förbättra synligheten av kanter EJV, är den mediala väggen markerad med en blå märkpenna längs loppet av den planerade venotomi. När EJV markeras, använd en 10-0 sutur att ligate den distala änden så caudal som möjligt och tillämpa en tillfällig kärl klipp på den proximala änden så kranial som möjligt.
- Med en fin 30 G nål och 0,5 ml spruta, göra en första öppning över det markerade området för EJV och omedelbart spola lumen med koksaltlösning för att undvika blodproppar bildas. Nästa, förlänga venotomi med microscissorstills längden är ca 2-3 gånger diametern på CCA. Undvik våldsam stretching och uppmärksamma att hålla en skarp och snygg framkant.
- Ungefärlig slutet av CCA till EJV. Gör en sidoskäret snitt i donator änden av CCA att justera diametern till längden till venotomi storlek (Figur 2).
4. End-to-side Anastomos
- Använd en 11-0 monofilament nylonsutur för CCA-till-EJV end-to-side anastomos. Suturering den mediala väggen av anastomos i en cráneo-caudal riktning är det första steget. Varje stygn bör placeras utanför-i venösa väggen först (Figur 3) och inifrån-ut artärväggen (Figur 4) nästa. Detta kommer att hålla knut på utsidan av de anastomotiska fartyg hela tiden (Figur 5). Antingen avbryts eller kontinuerliga suturer kan användas, men alla kontinuerliga suturer bör skärpas som det sista steget.
- Once den mediala väggen har sys, upprepa proceduren från kaudala att kraniell med sidoväggen. Nu varje stygn bör placeras utanför-i artärväggen först och inifrån-ut venösa väggen bredvid. Saline bevattning kommer att hålla lumen anastomosen synlig hela tiden under förfarandet.
- Efter avslutad alla stegen anastomosen, ta bort den tillfälliga klippet från venen först och från artären nästa. Den arteriella blod kommer att strömma in i EJV med ingen eller liten sipprar från anastomosen (se videor VH modell och VH modell 2). Den minimala blödningar bör sluta utan att använda bomull komprimering över anastomos. Detta måste undvikas för att förhindra trombos i den känsliga venen.
- När pulserande flöde genom anastomosen bekräftas och ingen uppenbar blödning observeras, skölj den kirurgiska området med koksaltlösning och stäng livmoderhalscancer snitt med en 6-0 nylonsutur. Slutligen administrera 0,15 ml mer av intraperitoneal brupenorphine för postoperativ smärtlindring och 0,2-0,4 ml subkutan 0,9% saltlösning för att fylla alla blodförlust under operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett lyckat resultat av modellen är en patent arteriovenös fistel som inducerar venös hypertension i murina hjärnan. För att validera den modell vi initialt den intrakraniella venösa trycket i sagital sinus av mössen vid 2, 3 och 4 veckor efter operationen. 6 olika möss tilldelades till varje gång-grupp. Sinus trycket var 8.8 ± 1,2 mmHg i gruppen mätte två veckor efter operationen. I de 6 möss uppmätta 3 veckor efter operationen, sinus trycket var 4.7 ± 1,4 mmHg. Slutligen de 6 möss mätte fyra veckor efter operationen hade ett sinus tryck på 3,9 ± 0,6 mmHg (Figur 6). Postoperativ 2 veckors sinus trycket var betydligt högre än sinus tryck vid 3 och 4 veckor (båda p <0,001).
Dock är den komplexa tekniken som krävs för att mäta sinus trycket inte nödvändig för att säkerställa fistel öppenhet och venös hypertension regelbundet. Istället kan det önskade resultatet bli checked genom direkt inspektion av fisteln och genom kliniska tecken på venös hypertoni i mus.
Öppenheten hos fisteln kan direkt inspekteras vid slutet av det kirurgiska förfarandet genom två metoder. Den första består av tillfällig hindrar EJV kraniala till anastomsis område med en guldsmeds pincett. Denna punkt är nu det enda utflöde av blodet kommer från CCA. Om slut till sida anastomos är patent kommer uttänjbar EJV omedelbart ballong ut som visas i öppenheten test video 1. Den andra metoden utförs genom sluta ventransplantat distalt om anastomosen och långsamt tömma den eller "mjölkning" det med ett par juvelerare pincett. Som framgår av andra video för öppenhet testet, när ocklusion frigörs, ett patent anastomos bör snabbt fylla på tömda segmentet.
Om modellen fungerar, bör utvidgningen av mus ögat noteras 24 h efter operationen. Detta MAy bero på bestod venös dränering av huvud och hals. Även om båda ögonen får förstorad efter operationen, är fenomenet mer framträdande på den opererade sidan som kan observeras i figur 7.
Figur 1:. Hud snitt En horisontell mittlinje livmoderhalscancer snitt över nedre halsområdet av musen och en mjuk dragkraft av spottkörtlarna exponerar rätt extern halsvenen (EJV). Notera den ytliga platsen för EJV som motiverar en noggrann hud snitt för att förhindra skador på den känsliga venen.
Figur 2:. Förbereda anastomosen Den mediala väggen i EJV har markerats med en blå linje längs loppet av den planerade venotomi. En sidoskurna incisionen i donator ände CCA utförs för att justera diametern för artären till längden till venotomi.
Figur 3:. Utifrån-in Den mediala vägg anastomosen är sys i ett cráneo-caudal riktning med 11-0 stygn först släpptes från utsidan-i venösa väggen.
Figur 4:. Inifrån-ut Nålen drivs här inifrån-ut artärväggen för att slutföra en sutur i den mediala väggen på lämpligt sätt för att hålla knuten på ytterytan av anastomos.
Figur 5: Att hålla knuten utanför not ho.w knut av den avbrutna sutur som valts i detta fall stannar utanför lumen på de fartyg för att undvika trombbildning som skulle täppa fisteln.
Figur 6:. Sinus tryckAnalys Denna bart diagrammet visar grafiskt skillnaden i intrakraniell sinus uppmätta trycket i mmHg vid 2, 3 och 4 veckor efter operationen.
Figur 7:. Proptosis En dag efter operation, båda ögonen är förstorade men det högra ögat utvidgningen (ipsilateralt till kirurgi) är mer framträdande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ihållande cerebral venös hypertension har närbesläktade med mer allvarliga kliniska manifestationer och dålig prognos hos patienter med durala AVFs och hjärn AVM 3. Dessa effekter av CVH har ofta studerats i råttmodeller 1,2,8. En motsvarande modell i musen skulle tillåta användning av genetiskt modifierade djur som i slutändan skulle göra det möjligt att analysera molekylära vägar inblandade på patogenesen av venös hypertension och dess förhållande till dural AVF och hjärn AVM.
Här rapporterar vi en metod för att skapa cerebral venös hypertension i den vuxna musen genom en end-to-side carotid-jugular fistel. Denna nya modell förbättrar väl beskrivna hals-jugular fistel modeller i råttan genom att översätta den till musen och därigenom låta den tidigare nämnda möjligheten att undersöka molekylära vägar och genterapier.
Vanliga problem och Förslag
En annan vanlig problem skadar venen med överdriven dragkraft, kompression, eller dissektion längs sitt lopp. Därför måste EJV exponeringen noggrant utfört under mikroskop för att identifiera en lämplig plan dissektion. Alla de små grenar som dränerar in i den bör också identifieras och koagulerade. Detta kommer att undvika okontrollerad blödning som kräver kompression av venen och kommer att ge tillräckligt med redundans för att undvika överdriven spänning.
Det är inte ovanligt att ha dålig funktion av fisteln efter avlägsnande av temporära clipsen. I det här fallet, bör det första steget vara leta efter möjliga poäng av spänning eller vinkling i CCA. Ytterligare dissektion av artären eller partiell resektion av sternocleidomastoideus kommer att lösa det här problemet. Men om dålig funktion fortsätter efter dessa manövrar, trombos av anastomos webbplatsen måste misstänkas. I så fall, i stället för att återuppta anastomos platsen och avlägsna tromben, vi rekommenderar att du utför en nyanastomos kraniell till den föregående. Enligt vår erfarenhet är omöjligt tredje anastomos. Det finns inte tillräckligt längden på EJV och musen inte tolererar narkos under en så lång tid.
Begränsningar av tekniken
De huvudsakliga begränsningar av denna teknik är: (1) den diminutiva anatomi fartygen kräver avancerade mikro kompetens och en längre inlärningskurva än för motsvarande modell i råtta; (2) öppenheten hos anastomosen ofta äventyras av blodproppsbildning och längden på musens EJV kommer endast att tillåta en extra försök att lösa denna fråga; och (3) operation kan ta upp till tre timmar, utsätta musen till en lång anestesi period. Men följande föreslås de tekniska förslagen ovan och hålla musen varm och släckt under förfarandet, kan ett patent CCA-till-EJV måste fullbordas och en hög överlevnad hos djuren som uppnåtts i vår erfarenhet.
En pålitlig och hållbar cerebral venös hypertension modell i möss är ett viktigt verktyg som kan tjäna ett brett antal ändamål inom cerebrovaskulär forskning 13-16. Genom att lägga till knockout-teknik av transgena möss, bör denna nya modell lätta ytterligare gen relaterad in vivo forskning för alla patologier i samband med cerebral venös hypertension.
Tidigare har andra författare beskrev det venösa hypertoni modellen i råtta och har använt den för att studera patofysiologin vid dural AVF och hjärn AVM 4,5,8,9. Vi beskriver nu metoden att framgångsrikt översätta denna samma modell till mössen, därför öppnar sina potentiella tillämpningar till alla typer av genetisk behandling testning.
Slutsats
Vi visar här ett protokoll för att uppnå ett patent CCA-till-EJV anastomos i vuxen mus. Denna fistel geren varaktig hjärna venös hypertension som har varit ett användbart verktyg för att utveckla olika modeller cerebrovaskulära sjukdoms i råtta. Genom att tillhandahålla denna första steg för att utveckla samma modeller i mössen, öppnar vi möjligheten att testa genetiska behandlingar för de cerebrovaskulära sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De experimentella förfaranden med försöksdjur har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of California, San Francisco (UCSF).
Författarna har inga potentiella intressekonflikter i samband med narkotika och material som används i detta förfarande.
Acknowledgments
Projektet är delvis stöds av NIH T32 GM008440 till Espen Walker, R01 NS27713 till William L.Young, P01 NS44155 till William L.Young och Hua Su, R21 NS070153 till Hua SU och av American Heart Association AHA 10GRNT3130004 till Hua Su. Dr Ana Rodríguez-Hernández stöds av ett bidrag från "Obra Social La Caixa"
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic. | VT5A010Q10 | |
| 11-0 Sterile Microsuture | Arosurgical Ic | VT4A00N07 | |
| DUROTIP Scissors | Aesculap | BC210R | |
| Micro-Adson Tissue Forceps | Aesculap | BD510R | |
| Microscissors | Aesculap | OC496R | |
| Micro Forceps #5 Jewelers | Aesculap | BD331R | |
| Angled Jewelers Forceps | Aesculap | BD329R | |
| Micro Suture Forceps | Aesculap | BD338R | |
| DUROGRIP Needle Holder | Aesculap | BM009R |
References
- Bederson, J. B., Wiestler, O. D., Brüstle, O., Roth, P., Frick, R., Yaşargil, M. G. Intracranial venous hypertension and the effects of venous outflow obstruction in a rat model of arteriovenous fistula. Neurosurgery. 29, 341-350 (1991).
- Gao, P., Zhu, Y., Ling, F., Shen, F., Lee, B., Gabriel, R. A., Hao, Q., Yang, G. Y., Su, H., Young, W. L. Nonischemic cerebral venous hypertension promotes a pro-angiogenic stage through HIF-1 downstream genes and leukocyte-derived MMP-9. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1482-1490 (2009).
- Kim, H., Su, H., Weinsheimer, S., Pawlikowska, L., Brain Young, W. L. arteriovenous malformation pathogenesis: a response-to-injury paradigm. Acta Neurochir. Suppl. 111, 83-92 (2011).
- Lawton, M. T., Arnold, C. M., Kim, Y. J., Bogarin, E. A., Stewart, C. L., Wulfstat, A. A., Derugin, N., Deen, D., Young, W. L. Radiation arteriopathy in the transgenic arteriovenous fistula model. Neurosurgery. 62, 1129-1138 (2008).
- Lawton, M. T., Stewart, C. L., Wulfstat, A. A., Derugin, N., Hashimoto, T., Young, W. L. The transgenic arteriovenous fistula in the rat: an experimental model of gene therapy for brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 54, 1463-1471 (2004).
- Schaller, B., Graf, R., Sanada, Y., Tolnay, M., Rosner, G., Wienhard, K., Heiss, W., D, Hemodynamic changes after occlusion of the posterior superior sagittal sinus: an experimental PET study in cats. AJNR Am J Neuroradiol. 24, 1876-1880 (2003).
- Zhu, Y., Lawton, M. T., Du, R., Shwe, Y., Chen, Y., Shen, F., Young, W. L., Yang, G. Y. Expression of hypoxia-inducible factor-1 and vascular endothelial growth factor in response to venous hypertension. Neurosurgery. 59, 687-696 (2006).
- Herman, J. M., Spetzler, R. F., Bederson, J. B., Kurbat, J. M., Zabramski, J. M. Genesis of a dural arteriovenous malformation in a rat model. J. Neurosurg. 83, 539-545 (1995).
- Terada, T., Higashida, R. T., Halbach, V. V., Dowd, C. F., Tsuura, M., Komai, N., Wilson, C. B., Hieshima, G. B. Development of acquired arteriovenous fistulas in rats due to venous hypertension. J. Neurosurg. 80, 884-889 (1994).
- Yassari, R., Sayama, T., Jahromi, B. S., Aihara, Y., Stoodley, M., Macdonald, R. L. Angiographic, hemodynamic and histological characterization of an arteriovenous fistula in rats. Acta Neurochir (Wien). 146, 495-504 (2004).
- Solheim, O., Skeidsvoll, T. Transient global amnesia may be caused by cerebral vein thrombosis. Med. Hypotheses. 65, 1142-1149 (2005).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. J Vasc Interv Radiol. 20, 946-950 (2009).
- Choi, E. J., Choi, E. J., Walker, E. J., Shen, F., Oh, S. P., Arthur, H. M., Young, W. L., Su, H. Minimal Homozygous Endothelial Deletion of Eng with VEGF Stimulation Is Sufficient to Cause Cerebrovascular Dysplasia in the Adult Mouse. Cerebrovascular diseases. 33, 540-547 (2012).
- Hao, Q., Su, H., Marchuk, D. A., Rola, R., Wang, Y., Liu, W., Young, W. L., Yang, G. Y. Increased tissue perfusion promotes capillary dysplasia in the ALK1-deficient mouse brain following VEGF stimulation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H2250-H2256 (2008).
- Su, H., Hao, Q., Shen, F., Zhu, Y., Lee, C. Z., Young, W. L., Yang, G. Y. Development of a cerebral microvascular dysplasia model in rodents. Acta Neurochir. Suppl. 105, 185-189 (2008).
- Walker, E. J., Su, H., Shen, F., Degos, V., Jun, K., Young, W. L. Bevacizumab Attenuates VEGF-Induced Angiogenesis and Vascular Malformations in the Adult Mouse Brain. Stroke; a journal of cerebral circulation. , (2012).
