Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes
Summary
Microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite obtener imágenes diferentes procesos biológicos en los animales vivos. En este artículo, presentamos un método detallado para obtener imágenes de la dinámica de las estructuras subcelulares, tales como los gránulos de secreción, en las glándulas salivales de ratones vivos.
Abstract
Aquí se describe un procedimiento para obtener imágenes de estructuras subcelulares en roedores vivos que se basa en el uso de microscopía intravital confocal. Como un modelo de órgano, utilizamos las glándulas salivales de ratones vivos, ya que proporcionan una serie de ventajas. En primer lugar, pueden ser fácilmente expuestos a permitir el acceso a la óptica, y se estabilizan para facilitar la reducción de los artefactos de movimiento debido a latido del corazón y la respiración. Esto facilita significativamente de formación de imágenes y el seguimiento de las pequeñas estructuras subcelulares. En segundo lugar, la mayor parte de las poblaciones de células de las glándulas salivales son accesibles desde la superficie del órgano. Esto permite el uso de microscopía confocal que tiene una resolución espacial más alta que otras técnicas que se han utilizado para la formación de imágenes in vivo, tales como la microscopía de dos fotones. Por último, las glándulas salivales pueden ser fácilmente manipulados genéticamente y farmacológicamente, proporcionando así un sistema robusto para investigar los procesos biológicos a nivel molecular.
En este estudio nos centramos en un protocolo diseñado para seguir la cinética de la exocitosis de los gránulos secretores de las células acinares y la dinámica de la membrana plasmática apical donde los gránulos de secreción se fusionan a la estimulación de los receptores beta-adrenérgicos. Específicamente, se utilizó un ratón transgénico que co-expresa GFP citosólica y un péptido membrana orientada fusionado con la proteína fluorescente tándem de tomate. Sin embargo, los procedimientos que utilizamos para estabilizar y la imagen de las glándulas salivales se pueden extender a otros modelos de ratón y acoplados a otros enfoques para etiquetar in vivo componentes celulares, lo que permite la visualización de varias estructuras subcelulares, tales como los endosomas, lisosomas, mitocondrias, y el citoesqueleto de actina.
Introduction
En las últimas dos décadas el advenimiento de la microscopía en vivo y el uso de proteínas fluorescentes han dado lugar a grandes avances en cada proceso celular imaginable, avanzando así en nuestra comprensión de la biología de las células 1. Este campo se ha beneficiado enormemente de la utilización de cultivos de células de mamíferos que son sistemas modelo extremadamente potentes, en particular cuando se trata de manipulaciones experimentales. Sin embargo, a menudo no proporcionan una verdadera representación de la biología de los organismos multicelulares complejos 2. Este problema ha empezado a abordarse por el desarrollo de la microscopía intravital (IVM), que ha abierto la puerta a la investigación de cuestiones biológicas fundamentales en campos como la neurobiología, la inmunología y la biología del tumor 3. Hasta ahora, la mayoría de los estudios sobre la base de IVM se han realizado a nivel de los tejidos y las células individuales, sin proporcionar ninguna información sobre la dinámica de los compartimentos subcelulares. Recientemente, nuestro laboratorio y otross han desarrollado técnicas de MIV capaz de obtener imágenes de estructuras subcelulares en roedores vivos 4-7, 13-15 y permitiendo las manipulaciones farmacológicas y genéticas en vivo. Este enfoque ha sido utilizado por nosotros para estudiar el tráfico de membrana in vivo, y más específicamente la endocitosis y exocitosis regulada 6,7.
Nuestro sistema modelo experimental se basa en la exposición, de estabilización y de imágenes de las glándulas salivales submandibulares (SGS) de roedores anestesiados. La elección de la SGS como un órgano modelo para la IVM es debido al hecho de que las glándulas son fácilmente accesibles mediante la realización de una cirugía menor, se puede exterioriza sin comprometer su fisiología, y estabilizado para reducir los artefactos de movimiento debido al latido del corazón y la respiración. Además, SGS puede ser manipulada genéticamente de forma selectiva mediante la inyección de vectores basados ya sea virales o no virales a través del conducto salival 8,9. Por último, SGS son glándulas exocrinas compuestas de epith polarizadocélulas Elial, que forman los acinos y los conductos, células mioepiteliales, y una población compleja de células del estroma. Por esta razón, son un modelo excelente para estudiar la exocitosis, endocitosis, la entrega de genes, y el citoesqueleto de actina, como se destaca en nuestros estudios recientes 10, y ofrecer la oportunidad de estudiar los aspectos de la biología celular, tales como la polaridad celular, la división celular, célula- uniones de las células, y los canales de iones.
En este trabajo se describe en detalle un protocolo de formación de imágenes para lograr la resolución subcelular en el epitelio de las Comisiones de Estudio de un ratón vivo. Específicamente, mostramos cómo reproducir los gránulos de secreción en las células acinares de las Comisiones de Estudio durante la exocitosis regulada. Como se indica anteriormente, a la estimulación con agonistas del receptor beta-adrenérgico, los gránulos secretores se fusionan con la membrana plasmática apical y el colapso gradualmente, liberando su contenido en los canalículos acinares 6. Nuestro objetivo es proporcionar las herramientas básicas para investigadores con minimal experiencia en procedimientos quirúrgicos y manipulación de los animales, de modo que puedan realizar con éxito IVM con una resolución subcelular. Desde la parte más difícil de IVM es la preparación del animal, aquí nos centramos en la descripción de los procedimientos quirúrgicos básicos que se utilizan para exponer e inmovilizar las Comisiones de Estudio, sin comprometer su función. En cuanto a los procedimientos para etiquetar estructuras subcelulares, varias estrategias, tales como la administración sistémica de sondas fluorescentes, el uso de animales transgénicos, o una combinación de ambos, se han descrito en otra parte 7,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasta ahora estructuras subcelulares han sido fotografiados en su mayoría en in vitro (es decir, los cultivos de células) o en ex vivo (es decir, las orga-culturas, rebanadas de tejidos, preparaciones acinares) sistemas de modelos que a menudo no recapitulan las características de los tejidos vivos intactos 6. En este sentido, el enfoque presentado aquí representa un avance importante ya que permite imágenes de las dinámicas de un paso el tráfico de membrana específico (es decir,…
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
Referências
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