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Bioengenharia

Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Published: July 12, 2013
doi:
10.3791/50575
, ,
1School of Chemistry and Biochemistry,Georgia Institute of Technology

Summary

Desorption Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (DESI-MS) ist eine Methode, mit der Umgebungsluft Proben, einschließlich biologischen Geweben, mit minimaler Probenvorbereitung abgebildet werden kann. Durch Rastern der Probe unterhalb der Ionisationselektrode, bietet dieses Spray-basierte Technik ausreichender räumlicher Auflösung auf molekularen Eigenschaften von Interesse in Gewebeschnitten zu erkennen.

Abstract

Massenspektrometrie Imaging (MSI) bietet ungezielte molekularen Informationen mit der höchsten Spezifität und räumlicher Auflösung für die Untersuchung von biologischen Geweben zu den hundert bis zehn Mikrometer-Skala. Wenn unter Umgebungsbedingungen durchgeführt wird Probe Vorbehandlung überflüssig und vereinfacht damit das Protokoll unter Beibehaltung der hohen Qualität der erhaltenen Informationen. Desorption Elektrospray-Ionisation (DESI) ist ein Spray auf Umgebungstemperatur MSI Technik, die für die direkte Entnahme von Oberflächen im Freien, auch in vivo ermöglicht. In Verbindung mit einem Software-gesteuerten Probentisch verwendet, wird die Probe unter der DESI Ionisationselektrode gerastert und in den Zeitbereich, m / z Informationen mit der chemischen Spezies räumliche Verteilung korreliert. Die Genauigkeit der DESI-MSI Ausgang hängt von der Quelle Ausrichtung und Positionierung in Bezug auf die Probenoberfläche und Massenspektrometer Einlass. Hier prüfen wir, wie man Gewebeschnitte für DESI vorzubereiten imaging und zusätzlichen experimentellen Bedingungen, die direkt auf die Bildqualität. Insbesondere beschreiben wir das Protokoll für die Bildgebung von Rattenhirn Gewebeschnitten durch DESI-MSI.

Introduction

Untargeted Bildgebung mittels Massenspektrometrie ermöglicht die Übernahme von chemischen Informationen für die Entdeckung und Hypothesen-generierenden Anwendungen. Gezielte Bildgebung eines bekannten chemischen von Interesse auf der anderen Seite kann eine erhöhte Empfindlichkeit und Selektivität durch spezifische Verfahren Entwicklung zu erleichtern. Massenspektrometrie Imaging (MSI) wird am häufigsten auf Gewebe mit MALDI, 1 Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS), 2 und Umgebungstemperatur Ionisation Techniken, einschließlich Desorption Elektrospray-Ionisation (DESI), 3 Laserablation-Elektrospray-Ionisation (LAESI), 4 durchgeführt, 5 und flüssigen Mikro-junction-Oberfläche Probenahmesonde (LMJ-SSP). 6 In MALDI und SIMS, müssen die Proben physikalisch aus der Probe entfernt werden, und müssen flach und dünn, wie sie im Hochvakuum analysiert. MALDI erfordert Beschichtung der Probe mit einer Strahlung absorbierenden Matrix, das Hinzufügen einer zusätzlichen und umständlich Schritt zur Probenvorbereitung. SIMShat die höchste laterale Auflösung, aber Beschuss mit hochenergetischen Teilchen verursacht umfangreiche molekulare Fragmentierung. Deshalb füllen MSI durch Umgebungslicht Methoden eine Nische, wo weiche Analyse mit minimaler Probenvorbereitung ist wünschenswert. Doch bis heute werden alle Methoden noch durch das Erfordernis der flachen Probe Flächen begrenzt.

DESI verwendet eine pneumatisch unterstützte aufgeladen Lösungsmittel Spray an der Probenoberfläche gerichtet zu desorbieren und zu ionisieren Analyten. 7 Das Arbeitsmodell für die Desorption und anschließende Ionisation durch DESI als "Tropfen Pick-up-Modell" bekannt ist. 8-10 Die geladenen primären Tröpfchen hergestellt von der DESI Sonde mit der Oberfläche kollidiert, Benetzung und Ausbildung einer Dünnschicht, in die der Analyt durch eine Fest-Flüssig-microextraction Mechanismus 8 Nachfolgende Tröpfchenkollisionen ergeben Impulsübertragung und Start des zweiten Tröpfchen, die das Material von der Oberfläche entnommen wird aufgelöst . 9,10 Letztlich GasPhase Ionen sind vermutlich durch ESI Fortsätze nach dem Ionenverdampfung, Ladung Rückstand Modelle oder andere Modelle, 11 hergestellt werden, wobei der genaue Ionenbildung Verfahren DESI erst noch zu experimentell bewiesen. 12 DESI Empfindlichkeit ist stark abhängig von der Löslichkeit der Analyt in dem Solvens, wie Desorption beruht auf der lokalisierten microextraction. 13

In Verbindung mit einem Software-gesteuerten Probentisch verwendet, wird die Probe mit unidirektional Spur Schrittmotors unter der DESI Ionisationselektrode abgetastet und durch den Zeitbereich, m / z Informationen mit der chemischen Spezies räumliche Verteilung (Fig. 1) korreliert. Seit dem ersten proof of principle DESI-MSI Experiment von Van Berkel und Kertesz im Jahr 2006 berichtet, hat 14 die Technik deutlich gereift 15 mit gemeldeten Anwendungen in der Analyse von Lipiden, 3,16 Drogenmetaboliten 17,18 disease Biomarker, 19 Hirngewebe, 3,18,20 Lungengewebe, 18 Nierengewebe, 18 Hodengewebe, 18 Nebennieren, 17 Dünnschichtchromatographieplatten, 21 und Algen Oberflächen. 22. Die Routine Auflösung von Bildern von DESI-MSI erhaltene 100-200 um, die letztlich durch die wirksame Fläche durch das Spray extrahiert wird bestimmt, sondern Auflösungen so niedrig wie 40 um berichtet worden. 23-25 ​​Solche Auflösung und einfache Analyse macht DESI-MSI geeignet für die schnelle und einfache Analyse von biologischen Gewebeproben mit Oberflächen im Bereich 0,5-5 cm 2, so dass der Erwerb von wertvollen Geodaten besser zu verstehen biologischen Prozessen 26. Hier wird als ein Beispiel für eine typische DESI-MSI-Anwendung, überprüfen wir die Einzelheiten des Verfahrens für die Durchführung einer erfolgreichen Experiment mit bildgebenden von Lipiden im Rattenhirn Gewebe. Die beiden wichtigsten Schritte in dem Protokoll sind dieGewebepräparation 27 und DESI Optimierung der Ionenquelle, wie unten beschrieben.

Protocol

1. Tissue Schnitte Shop-Flash-gefroren, ganz Gewebe in -80 ° C Gefrierschrank bis bereit zum Schneiden. Lassen Sie die Gewebeprobe, um die Temperatur in der Kryomikrotom erreichen, bevor Schneiden (30 min). Legen Sie die Klinge und Probentemperatur bis -30 ° C. Sobald Gewebe hat die Temperatur erreicht, die Handhabung der Probe mit einer Pinzette, geschnittene Vorder-oder Rückseite des Gehirns je nachdem, welcher Teil des Gehirns ist von Interesse für eine ausreichende Montagefläche <…

Representative Results

Abbildung 3 zeigt ein repräsentatives Spektrum von einer unbehandelten Rattenhirn Abschnitt erhalten. Im positiven Modus wird das Massenspektrum von Phosphatidylcholine aufgrund ihres hohen Ionisierungseffizienz (zurückzuführen auf die positiv geladenen quaternären Ammoniumgruppen) dominiert. Die gesamte Ionenbild der Gewebeschnitt ist auch in Fig. 3 gezeigt, mit umfangreicher Signal über den gesamten Abschnitt des Gehirns. Key Lipide erfasst sind in Tabelle 1 durc…

Discussion

Die Optimierung der DESI Quellgeometrie ist entscheidend für eine erfolgreiche MSI Experimente. Die mehreren Variablen, die zur Ausrichtung des Systems unmittelbar auf Empfindlichkeit und Auflösung. Wenn während der Optimierung, hat der Experimentator Schwierigkeiten bei der Beschaffung Signal, empfehlen wir die Verwendung rot Sharpie Stelle auf der Folie als Maßstab gezeichnet; der Farbstoff Rhodamin 6G, m / z 443, erzeugt ein starkes Signal in der positiven Ionen-Modus und kann verwendet werden für anfängliche O…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird durch ARRA NSF MRI Instrument Development Grant # 0923179 zu FMF unterstützt. Wir danken Aqua Asberry, Lab-Koordinator für die Parker H. Petit Institut für Bioengineering und Biowissenschaften Histologie Kern, für die Unterstützung bei Gewebe Schnitte.

Materials

Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura-Finetek 4583 http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile EMD AX0156-6 OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome Thermo Scientific CryoStar* NX70 Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray;DESI Spray Head Prosolia Inc. Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply Stanford Research Systems, Inc. PS350/5000V-25W http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller Omega http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview National Instruments Version 7.1
Translational stage Prior Scientific Optiscan II http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL JMS-T100LC Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface
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Referências

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Citar este artigo
Bennett, R. V., Gamage, C. M., Fernández, F. M. Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (77), e50575, doi:10.3791/50575 (2013).
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