Summary
Методы манипуляции и анализа NF-kB-зависимой взрослых гиппокампа нейрогенеза описаны. Подробный протокол представлен на зубчатой извилине зависит от поведения теста (называется пространственной структуры разделения-Barnes лабиринт) для исследования когнитивного тестирования на мышах. Эта техника также должна помочь разрешить исследования в других экспериментальных установок.
Abstract
Гиппокамп играет ключевую роль в формировании и консолидации эпизодических воспоминаний, и в пространственной ориентации. Исторически сложилось, что взрослый гиппокамп был просмотрен как очень статического анатомической области мозга млекопитающих. Тем не менее, последние данные показали, что зубчатая извилина гиппокампа является областью огромной пластичности у взрослых, с участием не только модификации существующих нейронных цепей, но и нейрогенез. Эта пластичность регулируется сложных транскрипционных сетей, в которых фактор транскрипции NF-kB играет важную роль. Для изучения и манипулировать нейрогенез, трансгенного модель мыши для переднего мозга конкретных нейронов ингибирования NF-kB деятельности могут быть использованы.
В этом исследовании, способы описаны для анализа NF-kB-зависимой нейрогенеза, в том числе его структурных аспектов, нейронов апоптоза и пролиферации предшественников и познавательного значения, whicч была специально установлена с помощью зубчатой извилине (DG)-зависимого теста поведенческой, пространственная модель сепарации-Барнс лабиринт (SPS-БМ). Протокол SPS-БМ может быть просто адаптированы для использования с другими трансгенных животных моделях, предназначенных для оценки влияния определенных генов на взрослого гиппокампа нейрогенеза. Кроме того, SPS-BM могут быть использованы в других экспериментальных условиях, направленных на изучение и манипулирования DG-зависимую обучения, например, с использованием фармакологических агентов.
Introduction
Онтологически, гиппокамп является одним из старейших анатомических структур мозга известных. Он отвечает за различные сложных задач, таких как ключевых функций в регулировании долговременной памяти, пространственной ориентации, а также формирования и консолидации соответствующей памяти. Анатомически, гиппокампа состоит из пирамидальных слоев клеток (слой pyramidale), включая Корню Ammonis (СА1, СА2, СА3 и CA4) регионов и зубчатой извилине (извилина Dentatus), который содержит гранулы клетки и несколько нейронных клеток-предшественников в пределах своей субгранулярной зоне . ЗК проецировать к области СА3 через так называемые моховых волокон (аксонов гранулярных клеток).
До конца прошлого века, взрослый мозг млекопитающих не считается статический орган не хватает сотовой пластичность и нейрогенез. Тем не менее, в течение последних двух десятилетий, все большее количество доказательств ясно демонстрирует нейрогенез, происходящие в по крайней мере,две области мозга, субвентрикулярной зоне (СВЗ) и зернистым зона гиппокампа.
Наши предыдущие исследования, и других групп, показали, что транскрипционный фактор NF-kB является одним из важнейших регуляторов молекулярной взрослого нейрогенеза, и что его результаты де-регулирования в тяжелых структурных гиппокампа дефектов и когнитивных нарушений 1-6. NF-kB является общее название индуцибельного фактора транскрипции состоит из различных димерных комбинаций пяти ДНК-связывающих субъединиц: p50, p52, с-Rel, RelB и p65 (RelA), последние три из которых имеют трансактивацию домены. В мозге, наиболее распространенная форма находится в цитоплазме является гетеродимером р50 и р65, которая хранится в неактивной форме на ингибитора каппа В (IκB)-белков.
Для изучения и непосредственно управлять NF-kB-приводом нейрогенез, мы используем трансгенных модели мыши для того, чтобы простой ингибирование все subun NF-kBего, в частности, в переднем мозге 7 (см. рисунок 1). Для этой цели, мы пересекаем воспитанный следующие трансгенных линий мышей, IκB / - и -/tTA. Трансгенное IκB / - линия была сгенерирована с использованием транс-доминирующее негативное мутант NF-kB-ингибитора IκBa (супер-репрессор IκBa-AA1) 8. В отличие от дикого типа IκBα, IκBα-AA1 имеет два серина мутировал в аланинов (V32 и V36), которые препятствуют фосфорилирования и последующей протеасомной деградации ингибитора. Для переднего мозга нейрон-специфической экспрессии в IκBa-AA1-трансгена, IκB / - мышей скрещены с мышей укрывательство кальций-кальмодулин-зависимой киназы IIα (CAMKIIα)-промотор, который может управляться тетрациклина транс-активатора (TTA) 9.
p65 нокаут-мыши имеют эмбриональную смертельную фенотип, в связи с массовым апоптоза печени 10, поэтому подход показано здесь обеспечивает элегантный методдля исследования роли NF-kB в послеродовом и взрослого нейрогенеза.
Классический поведенческий тест изучать пространственное обучение и память была описана в 1980 году Richard Morris, испытании, известном как вода-лабиринте Морриса (MWM) 11. В этом открытом поле водяной лабиринт, животные узнать вырваться из непрозрачного воды на скрытой платформе, основанной на ориентации и экстра-лабиринт киев. Сухой вариант MWM является так называемый Barnes лабиринт (BM) 12. Этот тест использует круглую пластину с 20 круглых отверстий, расположенных на границе пластины, с одной определенной отверстие как бегство окне, и визуальные подсказки экстра-лабиринт для ориентации. Обе экспериментальные парадигмы полагаться на поведение полета индуцированного отвращения грызунов `ы к воде, или открытых, ярко освещенных пространств. Оба теста позволяют расследование пространственной ориентации, и связанное с этим производительность памяти. Хотя гиппокамп играет общее и существенную роль в формировании пространственной памяти, гиппокампа гegions участвующие отличаться в зависимости от теста применяется. Память испытания в BM возникает из нейронной активности между enthorinal коры (ЕС) и пирамидальных нейронов, расположенных в СА1-области гиппокампа без вклада DG 13-16. В частности, классический BM главным образом зависит от возможности навигации с помощью моносинаптического височно-аммиачной пути от EC III в СА1 к ЕС V. Важно отметить, что DG является решающим, участвующих в так называемой пространственной распознавания образов 17, что подразумевает не только обработку визуальное и пространственное информация, но и превращение подобных представлений или воспоминаний в разнородных, непересекающихся представлений. Эта задача требует функциональный три-синаптическую цепь от ЕС II к ГД в СА3 к СА1 и ЕС VI, которые не могут быть проверены в BM 15.
Для решения этих задач, мы разработали SPS-BM в качестве теста поведенческой специально проверить зубчатой извилине зависит от познавательное представление в сотрудничествеуправляете животные, а в IκB / TTA супер-репрессора модели следующем NF-kB торможения. Важно отметить, что в отличие от MWM или BM, СПС-БМ может выявить тонкие поведенческие дефициты в результате обесценения нейрогенеза. С пространственно-шаблон-разделение строго зависит от функциональной цепи между ЕС II и ГД и СА3 и СА1 и ЕС VI, этот тест очень чувствителен к возможным изменениям в нейрогенеза, модификаций моховой волокна пути или изменение тканевого гомеостаза в пределах DG.
Технически, установка нашего теста основан на исследовании Clelland и соавт., В котором пространственная структура разделения был протестирован с помощью деревянного 8-руки радиально лабиринт (RAM) 19. В нашем модифицированной установки, восемь руки были заменены семь одинаковых желтых пищевых домов. Таким образом, методы показано здесь, в том числе анализ doublecortin-выражения (DCX +) клеток в гиппокампе, прогнозы моховой волокно, нервных клеток деATH и, в частности СПС-БМ, представленные здесь, могут быть применены к исследованию других мышиных моделях, включающих трансгены, которые оказывают влияние на взрослого нейрогенеза. Дальнейшие приложения могут включать в себя изучение фармакологических средств и оценке их влияния на ГД и пространственного разделения образов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление Этика
Это исследование было проведено в строгом соответствии с нормативно-правовыми актами правительства животного и аккуратно обращайтесь комитета, LANUV государственной Северный Рейн-Вестфалия, (Дюссельдорф, Германия). Все эксперименты на животных были утверждены LANUV, Дюссельдорф, номер лицензии 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Все усилия были предприняты, чтобы минимизировать стресс и количество животных, необходимых для исследования.
1. Уход животных и жилищного
- Все животные, используемые в протоколах, описанных здесь, должны находиться под конкретного патогена условиях, как определено Европейским лабораторных животных Ассоциации науки РФ (FELASA).
- Мыши должны храниться в стандартных клетках в температуре и влажности контролируемой (22 ° C) помещении, в суточных условиях (12 ч свет / темнота цикла) с HEPA фильтрованный воздух.
- Унифицированная пищи и воды должны быть обеспечены без ограничений. </ Li>
- Если IκB / TTA и IκB / - мышей управления используются, на основе ПЦР генотипирование должна быть выполнена для каждого животного, как описано в 7, 18.
- Кобели с разнице в возрасте менее четырех дней должны быть использованы для уменьшения индивидуальной вариабельности.
- (По выбору): Для NF-kB реактивации экспериментов, доксициклин должны быть введены в питьевой воде (2 мг / мл 2,5% сахарозы) в течение не менее 14 дней.
2. Пространственная структура Разделение-Барнс Лабиринт (СПС-BM)
- Все поведенческие испытания должны проводиться в соответствии с международными и местными руководящими принципами.
- ВАЖНО! Используйте только самцов мышей с шестимесячного возраста и старше. Разница в возрасте между животными одного серии испытаний должно быть не менее четырех дней. Тестирование должно выполняться одним и тем же оператором для каждой серии. Мыши должны получать стандартную диету до тестирования для дальнейшего увеличения мотивации частично приводимый в качествеWeet пищевой наградой.
- Настройка белый круглую пластину из твердого пластика (диаметр 120 см, см. рисунок 5А) в влажности и температуры контролируемой комнате (22 ° C), с подсветкой, по крайней мере 4 х 80 Вт и 3 х 215 Вт неоновых люминесцентных ламп . ВАЖНО! Убедитесь, что правильно освещение используется, как мотивация мышей ввести продовольственные домов частично обусловлено их отвращение к ярких, открытых местах.
- Настройте систему видео-слежения. Камера должна быть помещена 115 см выше центра пластины (см. фиг.5А).
- Прикрепите разноцветные экстра-лабиринт сигналы (ЭМС) к белому тканью в позициях легко видимых для животных, около 100 см от границы пластины (см. рисунок 5а).
- Тщательно очистите пластину с быстрым дезинфицирующим, что может удалить любой запах от экспериментальной установки.
- Поместите семь одинаковых желтых пищевых домов (12 см х 7 см х 8 см, см. рис 5а сильный>) на белой тарелке. Позиции должны быть однозначно отмечено (см. рисунок 5А).
- Наведите сладкой пищи гранул награды (четверть Froot Loop / пищевой дома Kellogs `ы) внутри всех пищевых домов на определенные позиции (см. рисунок 5А) только с одним определены дома еды быть в свободном доступе для животных (места нахождения F, см. Рисунок 5a ). Закройте нецелевых пищевые дома с прозрачной пленкой.
- Перед испытанием, выполните привыкание (за один день до начала выполнения задачи). Сделать все пищевые дома в свободном доступе и позволит мыши исследовать лабиринт свободно и получить награду пищи гранул (10 мин / животное).
- Переключите компьютер и камеру и начать системную видео-слежения программного обеспечения.
- Начните запись.
- Место животное на определенной начальной точки на круглой пластины (фиг. 5A, S: начальное положение) и позволить мыши для поиска пищевой дом целевого течение 10 мин.
- Стор видео-слежения.
- ВАЖНО! Очистите круглую пластину, и еда дома после каждого испытания с быстрым дезинфицирующим средством.
- Повторите тест в день в течение семи дней подряд (для каждого животного).
- Проанализируйте результаты (Задержка, пройденное расстояние и ошибки), используя соответствующие статистические программного обеспечения. Определите ошибки по мере приближения неправильное питание дом и / или контакта с правильной коробке без ввода и извлечения пищевого подкрепления гранул. Для сгруппированных анализа использовать двустороннюю ANOVA с Бонферрони после специальной теста.
- (По выбору) Жертвоприношение мышей и анализировать гиппокампа, как описано ниже.
3. BrdU маркировки
- Введите внутрибрюшинно 50 мг / кг внутрибрюшинно BrdU один раз в день в течение 3 дней (анализ дифференциации и интеграции) или 200 мг / кг внутрибрюшинно для одной инъекции (анализ пролиферации).
- Жертвоприношение животных, препарировать гиппокамп и подготовить 40 мкм разделы, как описано ниже.
- Денатурациисекций с 2 М HCl в течение 10 мин и инкубируют в 0,1 М боратного буфера в течение 10 мин.
- Этикетка серию один к двенадцати 40 мкм секций (240 мкм друг от друга) от каждого животного иммуногистохимическое, как описано ниже с использованием антител, направленных против BrdU.
- Количественно меченых клеток с помощью конфокальной микроскопии анализа по всему ростро-каудальной степени слоя гранулярных клеток и зернистым зоне. Умножение полученные числа на 12, чтобы получить оценочную общее количество BrdU-меченых клеток в гиппокамп и разделить на два, чтобы получить общее количество меченых клеток на DG.
4. Удаление интеллектов и подготовка криосрезы из Nonperfused Животные
- Соблюдайте локально утвержденные процедуры для эвтаназии животных. Мыши могут быть непосредственно подвергнуты эвтаназии путем смещени шейных позвонков.
- (Опционально) Животные могут быть под наркозом перед euthanization в соответствии с местными и международными рекомендациями, например, путем внутрибрюшинного Injeводств 0,8 мл Avertin для 33 г мыши (свежеприготовленный путем смешивания 150 мл маточного раствора, сделанный из 2,2 мг 2,2,2-tribromoethanol в 1 мл изоамилового этанола с 1,85 мл физиологического раствора или физиологическом буфере).
- Стерилизовать голову Бетадин (10% повидон-йода) пропитанной марли и тампон впоследствии марлей, смоченной в 70% этанола.
- Обезглавить животное с использованием соответствующих хирургические ножницы и потяните кожу в сторону.
- (Опционально) Фиксаторы могут быть применены, чтобы избежать спинка заднего запаздывающей кожи.
- Сделайте срединный разрез в черепе и осторожно вытащите фрагменты черепа в сторону.
- Осторожно снимите весь мозг с помощью соответствующего хирургический инструмент (например Мория Spoon).
- Предварительного охлаждения 25 мл 2-метилбутана в 50 мл химический стакан (например Schott Duran) до -30 до -40 ° С в сухом льду.
Примечание: Для свободно плавающего окрашивания "толстых" секций, которые идеально подходят для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, удалить мозг, мыть 3раз в буфере и хранят при температуре 4 ° С в забуференном фосфатом 30% раствора сахарозы в 50 мл пробирку, пока мозг не запал вниз (как правило, на ночь). - Аккуратно положите мозг на части Nescofilm (Parafilm) и накрыть достаточное количество TissueTek октября соединения, заморозить на Nescofilm в 2-метилбутан, хранить при температуре -80 ° С до использования.
Примечание: Для длительного хранения при температуре -20 ° C магазине в 9% сахарозы, 7 мм MgCl 2, 50 мМ фосфатного буфера, 44% глицерина. - Разрежьте мозг в 10-12 мкм толстых секций по соответствующим cryomicrotome.
Примечание: Для толстых, свободно плавающих секций, заморозить мозг на замораживающий микротом этапе соответствующей замораживающий микротом (например Райхерта Юнг, Frigomobil.) И сократить 40 мкм горизонтальные участки на -20 ° до - 25 ° С. Сбор разделы из ножа с тонкой кистью и собирать в буфере или держать в растворе для хранения (шаг 4,9) при температуре -20 ° С в течение длительного хранения. - Осторожно установите два ломтика на отдельных слайдов микроскопа. Наме Superfrost Ultraplus слайдов настоятельно рекомендуется, чтобы максимизировать сцепление секциях.
- Высушите слайды в течение 5 мин при комнатной температуре. Слайды можно хранить при -80 ° С до использования.
5. Подготовка разделов из перфузии животных
- Обезболить животных, как описано выше (шаг 4.2).
- Осторожно заливать животное транскардиально забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), содержащим гепарин (0,025 г/100 мл PBS) и прокаина (0,5 г/100 мл PBS) в течение 2-4 мин, а затем 4% параформальдегида в PBS в течение 10-15 мин . Перфузии оптимально выполнены перфузии через левый желудочек и открытия правого предсердия с использованием гидростатическое давление приблизительно 1,2-1,4 м или с использованием перистальтического насоса установлен в примерно 15 мл / мин. Оптимальные результаты перфузии в бледно-белой мозга с не будучи видимым не красные кровяные сосуды.
- Проанализируйте и после исправить мозги в 4% параформальдегида при 4 ° С в течение 24 часов.
- Криогенныйзащитить мозг в 30% сахарозы в PBS при 4 ° С в течение не менее 24 часов.
- Замораживание мозги на сцене замораживающий микротом.
- Подготовка 40 мкм горизонтальных участков из целых переднего мозга с помощью соответствующего замораживающий микротом.
- Слайды можно хранить в криопротекторов раствора (0,1 М фосфатный буфер, 50% глицерина, 0,14% MgCl 2, 8,6% сахарозы) при -20 ° С до использования.
6. Иммуногистохимия срезах мозга Nonperfused Животные
- После фиксации криосрезов, полученный как описано выше, с использованием -20 ° C холодным метанолом в течение 10 мин.
- Блок 5% нормальной сыворотки, содержащей 0,3% Triton-X (от вида, который был использован для повышения вторичного антитела) в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть 3 раза с 1x PBS и инкубируют с первичными антителами в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть 3 раза с 1x PBS и инкубировали с вторичными антителами при комнатной температуре в течение одного часа.
- Промыть 3 раза с 1x PBS
- Кулоновскогоnterstain разделе для ДНК с использованием Sytox зеленый, или DAPI (или альтернативный краситель ДНК).
- Промыть 3 раза с 1x PBS
- Вставить разделы в водной вложение среды.
- Пусть вложение среднего полимеризации, по крайней мере 48 часов.
7. Иммуногистохимия срезах мозга перфузии животных
- Блок как описано на стадии 6.2, и затем инкубируют фиксированные срезы головного мозга в растворе первичного антитела, разведенного в PBS, содержащий 0,3% Triton-X (свободно плавающих) в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть три раза 1x PBS и инкубируют в растворе вторичного антитела, разведенного в PBS, содержащем 0,3% Тритон-X (свободно плавающих) при комнатной температуре в течение 3 часов.
- Промыть 3 раза с 1x PBS
- Контрастирующая раздел для ДНК с использованием Sytox зеленый или DAPI (или альтернативный краситель ДНК).
- Промыть три раза 1x PBS
- Вставить разделы в водной вложение среды.
- Пусть вложение среднего полимеризации длят мере 48 ч.
8. Исследование прогнозам Мшистые Fiber
- Жертвоприношение животных, подготовить 40 мкм корональные разделы, как описано выше, и окрашивает гиппокампа раздел использованием антитела для нейрофиламентов М.
- Сканирование разделы на соответствующей длине волны с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для визуализации замшелые волокна и ядра. Запустите сканирование при малом увеличении.
- Используйте изображения низкой кратности для ориентации и целевой гиппокамп с прогнозами моховой волокна.
- Сканирование разделы (Z-секционирования) с высоким разрешением и большим увеличением.
- Анализ морфологического внешний вид и связность мшистых волокон визуализированных с помощью окрашивания для NF-М.
- (По выбору) Проанализируйте размер и объем гиппокампа лопастей. Используйте сигнал ДНК для измерения.
9. Фтор-Джейд C Анализ (нервных клеток Смерть)
- Жертвоприношение животных, рассекают hippocAmpus и подготовить 12 мкм секций, как описано выше.
- Пусть секции высохнуть в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Fix разделы в 4% PFA в течение 40 мин при комнатной температуре.
- Кратко мыть секции 3x с DDH 2 O.
- Инкубируйте разделы с 0,06% перманганата калия (KMnO 4) в течение 10 мин при непрерывном, осторожном встряхивании.
- Вымойте разделы 3x с DDH 2 O.
- Инкубируйте разделы с 0,002% Фтор-Джейд С раствору в течение 20 мин при комнатной температуре.
- (По выбору) для одновременного ядерных окрашивания, решение 0,002% Фтор-Джейд С можно с добавлением 10 мкг / мл DAPI.
- Кратко мыть секции 3x с DDH 2 O.
- Пусть секции высохнуть в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Инкубируйте секций с ксилолом (1 мин)
- Установите секции с использованием ксилола основе монтажное среды (DPX).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Скрещивание из IκB / - и TTA трансгенных линий мышей приводит к условной ингибирования NF-kB активности в гиппокампе.
Чтобы исследовать экспрессию IκBα-AA1-трансгена в двойной трансгенной мыши (фиг.1А), мозги были изолированы, cryosectioned и окрашивали с использованием антитела против GFP (зеленый флуоресцентный белок). Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показало высокую экспрессию трансгена в СА1 и СА3 регионах и в ГД (фиг.1В).
IκBα-AA1-трансген выражается в тип-2b предшественников, и принимает активное участие в промежуточных незрелых государств и в зрелых зернистых клеток.
Чтобы определить самую раннюю тип клеток, выражающую CAMKIIα-приводом IκBα-AA1 в гиппокампа нейрогенной области, криосрезы из гиппокампа от IκB / TTA животных окрашивали на doublecortin(DCX) и трансген (GFP). Конфокальной анализ показал GFP-сигналы у молодых DCX-положительных зернистых клеток, указывая индукцию экспрессии трансгена по CAMKIIα-активности (рис. 2, стрелки).
Нейронов NF-kB ингибирование через IκBα-AA1 снижает замшелые прогнозы волокна, а толщина и объем ГД.
Корональные разделы гиппокампе IκB / TTA и IκB / - мышей окрашивали на нейрофиламентов М (NF-M) для визуализации замшелые прогнозы волокна, и раскрыть сложную и пучковой организацию (рис. 3). У мышей IκB / TTA, прогнозы моховой волокна были сильно поражены. Кроме того, NF-kB ингибирование привело к значительному снижению suprapyramidal толщины лезвия и меньшего объема DG (фиг.3В).
Нейронов ингибирование NF-kB в мышах IκB / TTA приводит к повышенной нейронной вырождениярации, увеличение нейрогенез, и нарушается миграция DCX-выражающих предшественников.
Чтобы изучить потенциальные причины драматических структурных дефектов, свежие, нефиксированные срезы гиппокампа мышей IκB / TTA окрашивали фтор-Jade С, что позволяет конкретную обнаружение гибели нейронов (рис. 4а). Здесь резко возросло число вырождающихся нейритах наблюдались в двойных трансгенных животных, по сравнению с одиночными трансгенных управления. Кроме того, значительное увеличение расщепленных каспазы-3-положительных апоптотических клеток был обнаружен у мышей IκB / TTA. Напротив, иммуногистохимического окрашивания против DCX показали значительно увеличилось количество DCX + клеток в мозге мышей IκB / TTA. Кроме того, DCX + клеток в IκB / TTA-гиппокампе не были расположены исключительно в зоне под зернистым, но были также найдены в более глубоких областей DG (фиг.4В), тогда как DCX +-предшественники ян контрольные животные были локализованы почти исключительно в субгранулярной зоне. Чтобы проверить, если повышенное количество DCX-экспрессирующих клеток является результатом созревания ранних предшественников или непосредственно в связи с распространением DCX + клеток, BrdU вводили в гиппокампе из IκB / TTA и контрольных мышей, которые затем были cryosectioned и окрашивали DCX и BrdU (рис. 4). Для анализа пролиферации, вводили BrdU раз (см. фиг.4В, схему), с последующим анализом после 24 часов. Для анализа дифференциации, три инъекции проводились ежедневно, с последующим анализом после семи дней. После однократного BrdU-инъекции, никаких существенных различий в общем количестве BrdU-положительных клеток между IκB/tTA- и контрольных животных не наблюдалось, тогда как три последовательные инъекции-подход показал ясно повышенное количество BrdU / DCX + клеток в ГД мышей IκB / TTA. Это означает, что нарушается дифференциация или интеграция DCX-EXактуальные клетки, возможно, вызвало повышенные количества DCX + клеток, и предполагает, что тип-3 клетки были вовлечены.
Нейронов ингибирование результатов NF-kB в тяжелых обучения дефектов, о чем свидетельствует Разделение-Барнс Maze теста пространственной картины. Чтобы специально протестировать поведение двойной трансгенных мышей в DG-зависимой задачи мы использовали SPS-BM, в результате чего животные должны различать местах с тонкими различиями (рис. 5). В этом поведенческой испытании, IκB / - контрольные животные исследовали пищевые домов серийно в первый день эксперимента (рис. 5). После семи дней обучения, животные были в состоянии найти открытую продовольственной дом непосредственно. В противоположность этому, IκB / TTA животные продолжали исследовать продовольствие домов последовательно, даже после обучения (фиг.5В). Наблюдение значительным увеличением расстояния, пройденного и высокими задержками и эрROR ставки в IκB / TTA животных, по сравнению с IκB / - контрольных животных, предполагает, что эти животные были серьезные дефекты обучения (рис. 5, в).
Рисунок 1. Генерация условного переднего мозга конкретных ингибирования NF-kB деятельности. А. Схематическое изображение трансгенных моделей, используемых для изучения роли NF-kB в взрослого гиппокампа нейрогенеза. Кальций-кальмодулин-зависимой киназы IIα (CAMKIIα) промоутер управляемой тетрациклин трансактиватор (TTA) мышей используется для регулирования экспрессии транс-доминирующего негативного мутанта IκBa (IκBa-AA1 супер-репрессор в IκB мышей) в сочетании с зеленого флуоресцентного белка трассирующей (GFP). У мышей IκB / TTA, NF-kB хранится в цитоплазме в неактивном станцийт. е. по разрушается IκBa-AA1, которые могут быть обнаружены с помощью GFP-флуоресценции. Торможение может быть обращено доксициклин, который ингибирует TTA выражение Б. Представительство трансгена. В разных гиппокампа регионах мышей IκB / TTA (АК1, СА3 и DG). Криосрезов были получены из изолированных мозге IκB / - и IκB / TTA мышей, и фиксировали и окрашивали с использованием антитела против GFP. Обратите внимание, что трансген экспрессируется на высоком уровне в ГД. Де: Дендриты, Д. Г.: зубчатой извилине, М. Л.: молекулярная слой; SL: Слой лукидум. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. IκBa-AA1 трансген выражается в DCX-положительных, тип-2b progenit ПРС и принимает активное участие в дальнейших промежуточных состояний и в зрелых зернистых клеток. А. Cryosectioned Гиппокамп из IκB / TTA животных с doublecortin (DCX) окрашивания и выражения GFP выявить экспрессию трансгена в молодых DCX-положительных зернистых клеток (стрелки). Д.Г.: зубчатой извилине, М. Л.: молекулярная слой Б. Схематическое изображение трансгенной экспрессии в разных стадиях развития в процессе разработки гранул клеток.. IκBa-AA1-трансген выражение был обнаружен в DCX-положительных, Тип-2b предшественников, всех промежуточных незрелых государств и в зрелых зернистых клеток. Напротив, ранние типа 1 и типа 2а предшественники (лишенные DCX-выражение) не выразил трансген, и поэтому были не влияет на NF-kB торможения. Изменения после Kempermann др.. 20 Нажмите здесь, чтобы загрузить увеличенное изображение.
Рисунок 3. NF-kB торможение приводит к обесцененным проекций мшистых волокон и уменьшенной толщиной DG и объема у мышей IκB / TTA, по сравнению с одной трансгенной контроля (IκB / -). А. Иммуноокрашивание cryosectioned гиппокампе для нейрофиламентов М (NF-M) для визуализации замшелые прогнозы волокна. У контрольных мышей (IκB / -), сложная и пучковой организация замшелых волокон, соединяющих зернистых клеток их клеток-мишеней в СА3 очевидно, что была нарушена после нейронов ингибирования NF-kB в мышей IκB / TTA. Более того, экспрессия супер-репрессор привело к значительному снижению suprapyramidal толщиной лезвия (ср. стрелка на левой и правой панели) и уменьшенным объемом DG. Б. Количественное и статистического анализа структурных дефектов в результате NF-kB торможения. Непарное Т-тест, двухсторонний. Данные взяты из ОА-версии Imielski др.. 2 Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4. Ингибирование NF-kB в мышах IκB / TTA приводит к увеличению гибели нейронов, усиливается нейрогенез, и нарушенный миграционную картину DCX-экспрессирующих клеток. А. Neuron конкретных фтор-нефрит C окрашивание и увеличение числа расщепленных каспазы-3-позитивных клеток гиппокампа в секциях показывает более высокий уровень гибели нейронов у мышей IκB / TTA, чем в IκB / - Управление. Вырождающейся нейриты обозначены стрелками, и ядра помечены звездочками. Право на сайте: количественная оценка скола каспазы-3-роsitive клетки в гиппокампе предлагает существенно увеличена апоптоз в двойных трансгенных животных. B. Окрашивание гиппокампа криосрезов для DCX показывает увеличенное количество DCX-экспрессирующих клеток в двойных трансгенных животных. Обратите внимание, что DCX + клеток в IκB / TTA-гиппокампе не расположены исключительно в субгранулярной зоне, но мигрировали вглубь ГД чем в IκB / -. Контроль C. Левая панель: Для проверки влияния трансгена на пролиферацию, один BrdU впрыском была выполнена, в результате которой без существенных различий в количестве BrdU-позитивных клеток между IκB / TTA и управления правой панели:. Статистическая оценка показала значительное увеличение DCX-экспрессирующих клеток в IκB / TTA животных после трех ежедневных BrdU-инъекций. Анализ проводился семь дней после последней инъекции (тест дифференциации и интеграции). Значительное увеличение BrdU / DCX + был обнаружен в ГД Iмышей κB / TTA (п = 3). Данные частично взяты из ОА-версии Imielski др.. 2 Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 5. Установка и типичные результаты пространственной структуры разделения-Barnes лабиринт (SPS-BM). А. Слева: Схематическое изображение экспериментальной установки. Семь одинаковых пищевых дома (одного цвета, размера и формы) были размещены симметрично на определенных точках круглого, домашний пластины построен с жесткого инертного пластика (диаметр 120 см), с одним свободным месте (начиная точки, S). Разноцветные экстра-лабиринт сигналы (ЭМС) крепятся перед белому тканью в позициях легко видимого к животным, примерно 100 см от бПорядок пластины. Чтобы избежать ориентации по запаху, пищевые гранулы откладываются в каждом доме, но только один пищевой Дом доступны (закрытие сделаны из прозрачной пленки). Справа: Видеокамера сосредоточены на тарелке (расстояние до тарелки: 115 см), и фотографией набору параметров, включая экстра-лабиринт киев Б. Типичные экспериментальные результатов теста SPS-БМ.. IκB / - контроль животных исследует пищевые домов серийно в первый день серии испытаний, и открытая еда дом находится сразу после семи дней обучения. Напротив, мыши, IκB / TTA выявить хуже обучения, о чем свидетельствует серийного освоения даже после этапа обучения С. Сравнение параметров, измеренных в SPS-BM в IκB / -., И IκB / TTA животных. Двойные трансгенных мышей показывают существенные нарушения памяти (N = 9) по сравнению с контрольной группой (п = 8) по отношению к латентности, пройденное расстояние и частота ошибок. оценка ANOVA двусторонняя; планки погрешностей: SEM. Данные в B иС были взяты из ОА-версии Imielski соавт. 2 Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Взрослый нейрогенез, а также возможность его манипуляции через ингибирование NF-kB в нейронах, и его последующего возобновления через доксициклин, предлагает увлекательные систему для расследования новорожденных нейронов в головном мозге взрослых, а также в нейронной де-и повторного поколения . Красота этой системы является то, что NF-kB сигнальный путь торможения в нейронах приводит не только к изменениям в гибели нейронов, пролиферации предшественников и миграции, и серьезными структурными и анатомических изменений, но и в очевидных дефектов обучения. Важно отметить, что фенотип IκB / TTA животных может быть экспериментально отменено, и спас после введения доксициклином. Это возвращение фенотипа включает структурные аспекты, а также может привести к значительному улучшению DG-зависимых обучения 2.
Для обеспечения интерпретируемые исход для поведенческих экспериментов, очень важно, чтобы только самцов с возрастом Differeсть менее четырех дней будут использоваться. Кроме того, все серии испытаний должны быть выполнены одним и тем же оператором. Что касается комнату тестирования, мы настоятельно рекомендуем выполнять испытание в акустически изолированной среде, чтобы избежать стресса и потери внимания в результате внешних источников шума. Для предотвращения ориентацию, основанный на обнаружении запаха вместо экстра-лабиринт киев, закрытые пищевые дома не должны быть доступны для животного, и обычный воздух и запах циркуляции должно быть разрешено. Кроме того, пластина, используемая для испытания должны быть построены из нейтральным запахом и моющих средств-стойкого материала, и должны быть тщательно очищены от эксперимента к эксперименту. Другим потенциальным источником экспериментальной вариации освещенности комнаты. В качестве источника света должно быть достаточно ярким, чтобы позволить приобретение изображения, признание экстра-лабиринт киев, и, чтобы вызвать поведение полета, но они не должны быть интенсивностью, чтобы ослепить животное. Кроме того, мы предлагаем, проводящая испытания для каждого животного в то же времясуток, чтобы избежать циркадные вариации.
Mus Musculus имеет довольно хорошую способность видения, которое, в естественных условиях, в частности, используются для обнаружения территориальные границы на визуально поразительных особенностей (визуальные подсказки, как деревья) (Латам и соавт., И ее применения. Животных Behav. Научно. 86 (3-4 ), 261-289, 2004). В классическом эксперименте Balkema соавт. (Дж. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982) помещены 6, 0, и -7 диоптрический линзы в глазах мыши и не наблюдали значительных изменений восприимчивых размеров поля в сетчатке ганглиозных клеток. Из-за этой огромной глубины резкости визуальных стимулов (например, экстра-лабиринт сигналы) могут быть размещены в большом диапазоне расстояний перед мышей и остаются в фокусе. В нашем подходе, расстояние экстра-лабиринт сигналы от отправной точки был 30 см от границы пластины, которая в соответствии с литературе (например, 140 см в WOng соавт., Genes Brain Behav. 5 (5), 389-403, 2006)
Грызуны имеют тенденцию оставаться близко к стенам открытом поле. Такое поведение определяется как thigmotaxis (Barnett, SH, крыса: исследование в поведении, Aldline издательство, Чикаго, стр. 31-32, 1963). Недавнее исследование, проведенное О `Лири и др.. (Behav. Brain Res. 216 (2), 531-542, 2011) продемонстрировали, что C57BL/6J мыши показали лучшее обучение в лабиринте Barnes по сравнению с другими штаммами 12 мышей. 28% подвергаемых испытанию мышей использовали пространственного поиска, тогда как 64% использовали серийный-thigmotactic стратегии. Эти данные справедливо для небольшого лабиринта с диаметром 69 см с 15 см от стены окружающих. Однако мыши, протестирован на большой лабиринт без стен или intramaze сигналы, как наша установка (диаметр 120 мкм) были надежно показано доказательств для использования в основном экстра-лабиринт визуальные подсказки (см., например, Бах и др.., Сотовый. +81 вызванные, например, МС различий, пластина была повернута после каждого эксперимента.
Поведенческий тест может быть просто адаптирован для исследования влияния других факторов транскрипции на взрослого гиппокампа нейрогенеза, используя соответствующие модели мыши. Тем не менее, он в основном предназначен для проверки DG-зависимую обучения (разделение пространственная структура), и может не подходить для исследования нейрогенеза или дегенерации нейронов в других областях мозга. В этом отношении, использование SPS-BM далее ограничивается его DG-специфичностью (строгой зависимости от функционального цепи между ЕС II и ГД и СА3 и СА1 и ЕС VI), и поэтому не следует применять для исследования задач, связанных с моносинаптического ЕС III - АК1 - EC V - замыкание.
Будущие применения способов, описанных здесь, могут включать изучения влияния трансплантации стволовых клеток, фармацевтическимиTical лечения на взрослого гиппокампа нейрогенеза и тканевого гомеостаза в гиппокампе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Ангела Kralemann-Келера за отличную техническую поддержку. Экспериментальная работа описано здесь проводили в нашей лаборатории и была поддержана грантами немецкого исследовательского совета (DFG) в СК и ВК и гранта немецкого Министерства науки и образования (BMBF) в БК.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
anti-Doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | IHC, Dilution 1:2,000 |
anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2,000 |
Fluoro-Jade C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
Betadine | Mundipharma | D08AG02 | disinfectant |
Cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120 cm |
Buraton rapid disinfectant | Schülke Mayr | 113 911 | disinfectant |
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | TSE Systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilization/IHC |
Cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40 µm brain slices |
Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro-Jade C staining |
References
- Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
- Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus. PLoS One. 7, (2012).
- Zheng, M., et al. Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain. Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).
- Denis-Donini, S., et al. Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice. J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).
- Bracchi-Ricard, V., et al. Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice. J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).
- Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).
- Fridmacher, V., et al. Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection. J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).
- Whiteside, S. T., et al. C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa. B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).
- Mayford, M., et al. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science. 274, 1678-1683 (1996).
- Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice. Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Brun, V. H., et al. Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry. Science. 296, 2243-2246 (2002).
- Meshi, D., et al. Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment. Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).
- Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus. Science. 319, 1640-1642 (2008).
- Dupret, D., et al. Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis. PLoS One. 3, (2008).
- Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).
- Kaltschmidt, B., et al. NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling. Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, 210-213 (2009).
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).