Este protocolo descreve um método de microfabricação compatível para padronização de células em SiO 2. Um projeto parylene-C predefinido é photolithographically impresso em SiO 2. Após a incubação com soro (ou outra solução de ativação), as células aderem especificamente (e crescer de acordo com a conformidade de) subjacente parylene-C, enquanto está sendo repelido por SiO 2 regiões.
Plataformas padronização celular apoiar objetivos de pesquisa gerais, tais como a construção de redes neuronais in vitro pré-definidos ea exploração de alguns aspectos centrais da fisiologia celular. Para combinar facilmente padronização celular com Multi-Eletrodo Matrizes (AAM) e à base de silício "laboratório em um chip" tecnologias, um protocolo de microfabricação compatível é necessária. Descreve-se um método que utiliza a deposição do polímero parilene-C em SiO 2. Fotolitografia permite padronização precisa e confiável de parylene-C com resolução de nível micro. A subsequente activação por imersão em soro fetal bovino (ou outra solução de activação específica) resulta em um substrato no qual as células cultivadas aderem, ou são repelidos por, parileno ou SiO 2 regiões, respectivamente. Esta técnica permitiu padronização de uma ampla gama de tipos de células (incluindo as células primárias murino hipocampo, HEK 293 linha celular, teratocarcinoma neurônio-like humanoA linha de células, as células granulares do cerebelo de murino primários, e as células-tronco do tipo derivado de glioma humanas primárias). Curiosamente, contudo, a plataforma não é universal, reflectindo a importância das moléculas de adesão de células específicas. Este processo de padronização celular é rentável, confiável e importante pode ser incorporado em microfabricação padrão (de fabricação de chips) protocolos, abrindo o caminho para a integração da tecnologia microeletrônica.
Compreender os mecanismos que determinam a adesão celular e padronização de materiais sintéticos é importante para aplicações tais como engenharia de tecidos, descoberta de drogas e a fabricação de biossensores 1-3. Muitas técnicas estão disponíveis e em evolução, cada um levando vantagem dos fatores biológicos, químicos e físicos que influenciam a miríade de adesão celular.
Aqui, descrevemos uma técnica de células-padronização que utiliza processos inicialmente desenvolvidas para fins de fabricação de microeletrônicos. Como tal, a plataforma está bem colocado para permitir a integração a jusante de tecnologias de microeletrônica, tais como AAM, na plataforma de padronização.
A interface entre a membrana celular e um material adjacente é bidireccional e complexo. In vivo, as proteínas da matriz extracelular e fornecem a estrutura e força de impacto sobre o comportamento das células através de interacções com receptores de adesão celular. De igual modo, as células em vitro interagir com substratos sintéticos via camadas absorvidas de proteínas 4, enquanto influências físico-químicas também modular a adesão. Por exemplo, uma superfície de polímero pode ser tornado mais "molhável" (hidrofílico) por iões ou irradiação de luz ultravioleta, ou decapagem por tratamento com ácido ou hidróxido de 5. Métodos estabelecidos para a padronização de células tirar proveito destes e de outros mediadores da adesão celular. Exemplos incluem a impressão a jato de tinta 6, microcontact carimbar 7, imobilização física 8, 9 microfluídica, manipulação em tempo real de 10, e padronização seletiva molecular montagem (SMAP) 11. Cada um tem vantagens e limitações específicas. Um fator-chave no nosso trabalho, no entanto, é integrar padronização celular com sistemas microeletromecânicos (MEMS).
MEMS referem-se extremamente pequenos dispositivos mecânicos que funcionam com energia elétrica. Isto coincide com a nanoescala equivalente, nanoelectromechsistemas mecânicos. Este conceito tornou-se prática apenas quando as estratégias de semicondutores habilitado fabricação a ter lugar em microescala. Técnicas de microfabricação desenvolvidos originalmente para eletrônicos semicondutores têm sido inadvertidamente encontrado útil para outros usos, como a eletrofisiologia celular, por exemplo. Um objetivo a jusante chave é combinar essas tecnologias de microeletrônica com um processo de padronização de células de alta fidelidade (formando um dispositivo bioMEMS). Várias técnicas de células-padronização existentes e de outro modo confiáveis e práticas são incompatíveis com essa idéia. Por exemplo, o alinhamento preciso de quaisquer microelectrónica ou biossensores embutidos é fundamental para a sua eficácia, mas é extremamente difícil de conseguir utilizando uma técnica tal como microcontact estampagem.
Para contornar esse problema, estamos trabalhando em uma plataforma de padronização com base em 2 SiO que usa photolithographically impresso parylene-C. Fotolitografia envolve a transferência de recursos geométricos deuma máscara para um substrato por meio de iluminação UV. Uma máscara é projetado usando um programa de desenho assistido por computador apropriado. Mediante uma placa de vidro, uma camada fina de crómio não transparente representa o padrão geométrico desejado (uma resolução característica de 1-2 mm é possível). O substrato a ser modelado é revestida com uma fina camada de material fotosensitivo (um polímero sensível ao UV). O polímero revestido é então alinhada e trouxe em contato próximo com a máscara. Uma fonte de UV é aplicada de tal modo que as áreas não protegidas são irradiadas e, portanto, tornam-se solúveis e removível na próxima etapa de desenvolvimento, deixando uma representação parilene-C do padrão de máscara de trás. Este processo originou durante o desenvolvimento de dispositivos semicondutores. Como tal, as bolachas de silício são frequentemente utilizadas como um substrato. Deposição de fotolitografia de parylene-C em SiO 2, portanto, é um processo simples e confiável que rotineiramente ocorre em instalações de salas limpas microeletrônicos.
Enquanto parylene temvárias características desejáveis de bioengenharia (quimicamente inerte, não bio-degradável), um fator restritivo de utilização direta na padronização celular é a sua adesividade celular inata pobres, atribuída em parte à sua extrema hidrofobia. No entanto, parilene-C tem sido anteriormente utilizada indirectamente para a padronização de células, por exemplo, como uma casca-de distância modelo celular 12,13. Esta abordagem é limitada pela baixa resolução e requer várias etapas. O processo aqui descrito utiliza um passo em vez de corrosão ácida, seguido por incubação de soro, para assegurar que as regiões de parileno-C tornar célula-adesiva, por meio de uma combinação de redução e na hidrofobicidade da proteína de ligação do soro.
O resultado final é uma estrutura composta de dois substratos diferentes, o que, depois da activação biológica, manifestam respectivas características cito-adesivas ou cito-repulsivo e assim representa uma plataforma pattering celular eficaz. É importante notar, não há necessidade de introduzir um g biológicaentos para a instalação de salas limpas como os substratos padronizados podem ser armazenados indefinidamente antes de ser utilizado (após o que são activados utilizando soro fetal de bovino ou de outra solução de activação).
Esta plataforma padronização parylene-C/SiO 2 é, portanto, um bom candidato para uma coalizão com os componentes de MEMS, como os processos de fabricação tão estreitamente espelhar as utilizadas para a fabricação de microeletrônica.
Imersão das fichas em ácido piranha serve não só para remover qualquer material orgânico residual, mas também grava as superfícies do substrato. Isso é fundamental para que a ativação efetiva com soro fetal bovino. Não fazer isso impede célula-padronização e altera profundamente o comportamento das células on-chip. Não há nenhuma exigência para esterilizar fichas após a limpeza com ácido piranha. Com efeito de esterilização por exposição aos raios UV demonstrou prejudicar padronização de células de uma forma dependente da dose 13. Cuidados devem ser tomados para lavar tudo photoresist residual após o processo de fotolitografia. Persistindo photoresist pode atuar como uma camada de cito-adesiva indesejado que substitui padrões ditados por parylene-C/SiO 2 geometria. A acetona é eficaz quando se utiliza o processo de fotolitográfica descritos acima e com os reagentes especificados. No entanto, outros tipos de material fotoresistivo pode necessitar de um solvente diferente.
Para avaliar o impacto eo sucesso da difereetapas de fabricação nt, o ângulo de contacto dos dois substratos de contraste pode ser medido. Figura 2 ilustra as alterações que ocorrem durante o processo de activação de chip. É provável, contudo, que o adesivo específico e componentes proteicos repulsivas em soro acabará por permitir o chip-modeladas parilene para exercer as suas respectivas características cito-adesivas ou cito-repulsivo.
Todos os resultados representativos utilizados fichas com uma espessura parylene de 100 nm, embora tenhamos modelada com sucesso usando camadas parylene tanto mais grossas e mais finas. Mais importante, esta técnica gravura fotolitográfico permite um controlo muito maior tridimensional de configuração parilene do que ilustrado aqui. Por exemplo, usando uma combinação de máscaras, é possível criar regiões parylene de espessura mista. Isso abre o caminho para a criação de culturas de células com topografia tridimensional definido, indo além das regiões simplesmente ditando de adesão celular / repulção, oferecendo potencialmente um meio de integrar canais microfluídicos para a construção.
Como mostrado, no entanto, esta plataforma padronização não é universalmente eficaz em todos os tipos celulares. Linhagens celulares diferentes, com seus perfis molécula de adesão celular variados, sem surpresa se comportam diferentemente quando cultivadas nesta plataforma. Nós ainda não identificaram os principais componentes no soro, nem os receptores da membrana celular de cortesia, que se baseia essa plataforma célula-padronização. Ao fazê-lo, no futuro, promete ampliar a sua utilidade e especificidade. Por exemplo, uma linha de células "não-padronização 'pode ser geneticamente modificado para expressar a molécula de adesão necessária e assim promover a padronização.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust uma bolsa de doutoramento Clínica (CAAT).
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |