Сотовый Patterning на фотолитографически установленными Parylene-C: SiO₂ Подложки

Summary

Этот протокол описывает способ микротехнологий-совместимый для клеток паттерна на SiO _2. Предопределенный дизайн парилен-С фотолитографически напечатаны на SiO ₂ пластин. После инкубации с сывороткой (или другого решения активации) клетки придерживаться специально для (и расти в соответствии с соответствием), лежащей в основе Parylene-C, в то время как отбиваясь от SiO ₂ регионах.

Abstract

Сотовый паттерна платформы поддерживают широкие исследовательские цели, такие, как строительство предопределенных нейронных сетей в пробирке и изучения некоторых центральных аспектов клеточной физиологии. Чтобы легко комбинировать клеток паттерна с многоэлектродной массивов (МПС) и на основе кремния "лаборатории на чипе» технологий, протокол микротехнологий-совместимая требуется. Мы опишем метод, который использует осаждение полимера Parylene-C на SiO ₂ пластин. Фотолитография позволяет точную и достоверную паттерна Parylene-C с разрешением микронного уровня. После активации путем погружения в эмбриональной телячьей сыворотки (или другого конкретного активирующего раствора) приводит к подложке, в котором культивируемые клетки придерживаться, или отталкивает, парилена или SiO ₂ областей соответственно. Эта методика позволила паттерна в широком диапазоне типов клеток (в том числе первичных мышиных клеток гиппокампа, HEK 293 клеточной линии, человеческий нейрон-подобных тератокарциномыклеточная линия, первичные мышиные гранулярных клеток мозжечка, и первичные человека глиомы стволовые-подобные клетки). Интересно, однако, платформа не является универсальным; отражает важность клеточных конкретных молекул адгезии. Этот процесс клеточной рисунка является экономически эффективным, надежным и, что важно, могут быть включены в стандартный микротехнологий (производственные чип) протоколы, прокладывая путь для интеграции микроэлектронной технологии.

Introduction

Понимание механизмов, которые диктуют клеточную адгезию и формирование паттерна на синтетических материалов имеет важное значение для приложений, таких как тканевой инженерии, лекарственных препаратов, а также изготовления биосенсоров ^1-3. Многие методы доступны и развивается, каждый из которых принимает преимущество из множества биологических, химических и физических факторов, которые влияют на клеточную адгезию.

Здесь мы описываем технику клеток-паттерна, который использует процессы изначально разработанные для микроэлектронных целей изготовления. Таким образом, платформа занимает хорошее положение для того, чтобы вниз по течению интеграции микроэлектронных технологий, таких как МПС, в паттерна платформы.

Интерфейс между мембраной клетки и смежной материала является двунаправленным и сложным. В естественных условиях, белки внеклеточного матрикса обеспечивают структуру и прочность и воздействие на поведение клеток через взаимодействие с рецепторами клеточной адгезии. Аналогичным образом, клетки в VИтро взаимодействовать с синтетических субстратов через поглощенных слоев белков ⁴ в то время как физико-химические влияет также модулировать адгезию. Например, полимер поверхность может быть оказана более "смачиваемые" (гидрофильные) ионами или ультрафиолетового облучения светом, или травлением путем обработки кислотой или гидроксида ^5. Штатные методы клеточной паттерна воспользоваться этим и другим клеточной адгезии посредников. Примеры включают струйной печати ^6, микроконтактная штамповки ^7, физической иммобилизации ^8, микрофлюидики ^9, в режиме реального времени управлять ¹⁰ и селективного молекулярного кучность сборки (SMAP) ^11. Каждый из них имеет специфические преимущества и недостатки. Ключевым фактором в нашей работе, однако, заключается в интеграции клеток паттерна с микроэлектромеханических систем (MEMS).

MEMS см. чрезвычайно малых механических устройств, управляемых электроэнергии. Это пересекается с наноразмерных эквивалентной, nanoelectromechветствующий квантовомеханический системы. Эта концепция стала практическая только тогда, когда полупроводниковые стратегии включен изготовление пройдет на микроуровне. Методы микротехнологий, разработанные первоначально для полупроводниковой электроники непреднамеренно оказалась полезной для других целей, таких как сотовые электрофизиологических, например. Ключевым вниз целью является объединить такие микроэлектронных технологий с процессом клеточного паттерна высокой точностью (формирование устройство bioMEMS). Несколько существующих и иным надежные и практические методы клеточной паттерна несовместимы с этой идеей. Например, точное выравнивание ни встроенных микроэлектроники или биосенсоров лежит в основе их эффективности, но чрезвычайно трудно достичь с использованием методики, такие как микроконтактной тиснения.

Чтобы обойти эту проблему, мы работаем на SiO ₂ на основе паттерна платформы, которая использует фотолитографически печатную Parylene-C. Фотолитография включает передачу геометрических характеристик отМаска на подложку через УФ-освещении. Маска разработан с использованием соответствующей программы автоматизированного проектирования. После стеклянную пластину, тонкий слой непрозрачной хрома представляет желаемый геометрический рисунок (разрешение особенностью 1-2 мм возможно). Подложка быть с узором покрыта тонким слоем фоторезиста (УФ-чувствительного полимера). Полимерным покрытием затем выровнена и приведены в тесном контакте с маской. Источник УФ наносят таким образом, что незащищенные участки облучают и, следовательно, становится растворимым и съемный на следующей стадии развития, оставляя парилен-C представление шаблоне маски позади. Этот процесс возник в процессе разработки полупроводниковых приборов. Таким образом, кремниевые пластины часто используют в качестве субстрата. Фотолитографическое отложение Parylene-C на SiO _2, следовательно, простой и надежный процесс, который обычно происходит в микроэлектронных объектов чистых помещений.

В то время как парилен имеетнесколько желательные характеристики биоинженерии (химически инертен, не к биологическому разложению), фактором, ограничивающим ее непосредственное использование в клеточной паттерна является его врожденно бедных адгезия клеток, частично отнести на его крайней гидрофобность. Тем не менее, парилен-С ранее использовалось косвенно для сотового паттерна, например, в виде корки на выезде сотовой шаблона ^12,13. Этот подход ограничивается низким разрешением и требует нескольких шагов. Способ, описанный здесь, а не использует кислота Стадия травления, а затем в сыворотке инкубации, чтобы гарантировать, что парилен C-области становятся клеток клей, с помощью комбинации снижением гидрофобности и сывороточного белка привязки.

Конечный результат представляет собой конструкцию, состоит из двух различных подложках, которые после биологической активации, проявляются соответствующие цито-клеевые или цито-отталкивающим характеристики и так представляет эффективную платформу клеток стучит. Важно отметить, что нет необходимости вводить биологическую AGЭнты в чистых помещениях объекта, как узорчатые субстраты можно хранить неопределенно долго до использования (после чего они активированы с помощью фетальной бычьей сыворотки или другое решение активации).

Это parylene-C/SiO ₂ рисунка платформа поэтому является хорошим кандидатом для коалиции с компонентов МЭМС, так как процессы изготовления так тесно зеркало тех, которые используются для микроэлектронной изготовления.

Protocol

1. Изготовление Parylene Узоры на SiO 2: Технологическая схема (см. рисунок 1) Дизайн желании конфигурацию парилен-C с использованием программного пакета редактор макета, способный чтения / записи CIF (Caltech промежуточная форма) или файлы GDS-II (Графический База данных система-II). CIF и GDS-II являются отраслевые стандартные форматы файлов для топологии интегральных микросхем работа. Комиссия фотомаской производство на объекте соответствующие микроэлектроники, или сделать в доме, если существуют объекты. Oxidize кремниевой пластины в атмосферном горизонтальной печи (H 2 1,88 ОДС и ​​O 2 1.25 ОДС) при 950 ° С в течение 40 мин с получением SiO 2 слой 200 нм (подтвердить толщину с небольшим точечной спектроскопического рефлектометра). Премьер окисляется пластины силановым адгезии. Теперь депозит Parylene-C при 22 ° С со скоростью 1,298 нм / мг димера с помощью системы вакуумного осаждения, специально предназначенные для нанесения Parylene. 100нм парилен-C покрытие используется для всех примеров, приведенных ниже. Следующая депозит гексаметилдисилазаном (HMDS) адгезии на Parylene покрытием пластины с использованием подходящего фото-сопротивляться систему покрытия. Теперь вращать подложку при 4000 оборотах в минуту в течение 30 сек в то время как применение положительный фоторезист (в результате теоретического толщиной 1 мкм), с использованием той же системы покрытия фоторезиста как описано выше. Мягкий испечь вафли в течение 60 сек при 90 ° С Вставьте как пластины и заранее изготовленным просмотром маску в маски Aligner. Защиту фоторезиста покрытием пластины с УФ отрицательного представления требуемой конфигурации парилен-C. Выпекать подвергается пластины в течение 60 сек при 110 ° С Удалить все подвержены фоторезиста от пластины, развивая в подходящем растворе разработчиков. Etch от незащищенного Parylene. Используйте систему кислородной плазмы травления (при давлении 50 мТорр камеры, 49 SCCM O 2, 100 Вт мощности РФ в 13,56 МГц, а такжескорость травления 100 нм / мин), чтобы выявить основные SiO 2. Нарезать пластину с помощью соответствующего перетасовки пилу (скорость вращения шпинделя 30000 оборотов в минуту, скорость подачи 7 мм / сек). Промыть фишки в деионизированной Н 2 О и сушить азотом. Храните чипы (бесконечно) в пыли бесплатно коробок, пока не требуется. 2. Чип для очистки и активации: Протокол Удалите остатки фоторезиста от чипов промывкой в ​​ацетоне в течение 10 сек. Промыть в деионизированной Н 2 О 3-кратным. Составляют свежий пираньи кислоты (соотношение 5:03 из 30% перекиси водорода и 98% серной кислоты). ВНИМАНИЕ: Подготовка пираньи кислоты с большой осторожностью. Это чрезвычайно сильным окислителем, сильно кислой, и смешивание перекиси водорода с серной кислотой является экзотермической реакцией. Выполните этот этап в кислой вытяжной шкаф. Позвольте 2 мин пройти после смешивания пираньи кислоту, но использовать в течение 20 мин. Чистые и травления чипы погружением в пиranha кислота в течение 10 мин. Промойте чипы 3x в деионизированной H 2 O и трансфер в стерильной культуре блюдо. Теперь активируйте чипы для клеток кучность стрельбы. Например, можно добавить две микросхемы на лунку в 6-луночный планшет и затем добавляют 2 мл фетальной бычьей сыворотки таким образом, чтобы полностью погрузить все фишки. Выполните это, и все последующие этапы культивирования клеток, в стерильных условиях в культуре ткани ламинаре. Выдержите фишки в сыворотке в течение 3-12 часов при температуре 37 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2,4-2,7 должны выполняться последовательно и без задержек между ступенями. Если активация сыворотки задерживается на ≥ 24 ч после пираньи обращение, сотовый рисунка нарушается в связи с сокращением отталкивания клеток из SiO 2 регионах. Альтернативные решения активации, содержащие специфические белки клеточной адгезии может быть использован вместо эмбриональной телячьей сыворотки. Такие решения изменить клеточной адгезии характеристики двух контрастных субстратов (см. репрезентативные результаты для примера). </li> 3. Плакировка Клеточные линии на-чипе: Протокол Удалить чипы от их решения активации и мыть один раз в течение 10 сек в Хэнка сбалансированный солевой раствор. Поместите микросхему в культуре хорошо и пластины выбранный тип клеток в виде суспензии в своей обычной ростовой среде. Оптимальная плотность клеток покрытие зависит как от типа клеток и геометрическим рисунком из Parylene-C на-чипе. Плотность 5 х 10 4 клеток / мл является разумным отправной точкой. Обработка изображений с учетом базовой мотивации для формирования паттерна клеток, но поведение живых клеток можно легко оценить, используя рассекает микроскопом и цифровой камеры с подходящим реле линзы.

Representative Results

Фотолитографический процесс формирования рисунка SiO 2 с Parylene-C показан на рисунке 1. После приготовления активации чипов в эмбриональной бычьей сыворотки позволяет широкий диапазон типов клеток, которые будут образцу в культуре. Наша группа успешно рисунком первичных мышиных клеток гиппокампа 14-16, клеточной линии НЕК 293 17, человеческое нейроноподобных тератокарциномы (HNT) линии клеток 18, первичные мышиные гранулярных клеток мозжечка и первичные человеческие глиомы стволовые-подобные клетки. На рисунке 3 показана надежную паттерна НЕК 293 клеток на Parylene картины, состоящей из круглых узлов с "перекрестия" расширений. Чип активации в этом примере был с эмбриональной бычьей сыворотки. Напротив, Рисунок 4 иллюстрирует потенциал для увеличения паттерна платформу с помощью решения альтернативой активации. Использование раствора бычьего сывороточного альбумина (3 мг / мл) и фибронектина (1 мкг / мл) в HBSS, предыдущий рисунка предписание был инвертирован. Фиг.5 иллюстрирует другой тип клеток (первичных человеческих стволовых, как линии клеток, полученную из высококачественной глиомы). Здесь, геометрия поведения основной узор воздействий клетки, с узором показано на фиг.4А стимулирования роста клеток процесса вдоль тонкой Parylene-C отслеживает, как показано на фиг.4В и 4С. Некоторые типы клеток не образец при использовании установленного плода протокол активации бычьего сывороточного. Рисунок 6 иллюстрирует 3Т3 L1 клетки растущих до слияния без каких-либо заметных цито-отталкивания или цито-клей разницы между Parylene-C и SiO 2 областях. pload/50929/50929fig1.jpg "/> Рисунок 1. Алгоритм, иллюстрирующий процесс изготовления парилен-C узоры на SiO 2. Рисунок 2. Диаграммой процессов, иллюстрирующей изменение угла контакта для узорчатых парилен-C и SiO 2 доменов на стадиях активации чип. Рисунок 3. Живых клеток визуализации НЕК 293 клеток, культивируемых на parylene-C/SiO 2 после трех дней в пробирке. Chips инкубировали в течение 3 ч в эмбриональной бычьей сыворотки, после чего клетки былипокрытием в виде суспензии в концентрации 5 × 10 4 клеток / мл. Parylene-С способствует клеточной адгезии в то время как голые SiO 2 отталкивает клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4. Живых клеток визуализации НЕК 293 клетки, культивированные на parylene-C/SiO 2 после трех дней в пробирке Chips активированные в течение 3 часов в различных растворах рационализованной активации. A: фетальной бычьей сыворотки, B: витронектина (1 мкг / мл) в HBSS, C: бычий сывороточный альбумин (3 мг / мл) + витронектина (1 мкг / мл) в HBSS, D: бычий сывороточный альбумин (3 мг / мл) + фибронектин (156; г / мл) в HBSS. Клетки высевали были в суспензии при плотности 5 × 10 4 клеток / мл. Обратите внимание, как отличается лечение чипа привело к отмене предыдущего паттерна догмы, с SiO 2 теперь клея и парилен-С отталкивания. Parylene-С диаметр узла 250 мкм, взято из Хьюз и др. 17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 5. Иммунофлуоресценции образы первичных человеческих глиомы стволовых-подобных клеток, выращенных на различных форм Parylene-C на SiO 2 A:. Схему, иллюстрирующую конструкцию ретикулярная Parylene показанный на В и С </strong> B:.. Флуоресценции микрофотография фиксированных клеток (после 4 дней в пробирке) окрашивали в течение глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP) C:. Свет микрофотография живых клеток на одном чипе D: флуоресценции изображение, иллюстрирующее GFAP-окрашенные клетки на другом парилена . конструкция E:. отражения образ узла и спицами Parylene отображается в D Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 6. Живая клетка визуализации 3T3 L1 клеток, культивируемых на parylene-C/SiO 2 после четырех дней в пробирке. Чипсы активированные в течение 3 часов в эмбриональной телячьей сыворотки после жакие клетки высевали в виде суспензии (3 × 10 4 клеток / мл). В этом случае, платформа не позволяет паттерна, с клетки становятся одинаково сливающийся на парилен-C и SiO 2 регионах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Погружение чипов в пираньи кислоты служит не только для удаления остатков органических материалов, но и вытравливает поверхностей подложек. Это ключ к создания условий для эффективного активацию с эмбриональной телячьей сыворотки. Невыполнение этого требования предотвращает клеточную кучность и глубоко изменяет поведение клеток на чипе. Там нет требования, чтобы стерилизовать фишки после очистки пираньи кислоты. Действительно стерилизация ультрафиолетового облучения было показано подорвать клеток паттерна в зависимости от дозы ^13. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы смыть все остатки фоторезиста после процесса фотолитографии. Сохранение фоторезиста может выступать в качестве нежелательного цито-клей слоя, который переопределяет кучность продиктованный parylene-C/SiO ₂ геометрии. Ацетон является эффективным при использовании процесса фотолитографии описанное выше и с реагентами, указанными. Тем не менее, другие типы фоторезиста может потребовать иного растворителя.

Для оценки влияния и успех DiffereNT шаги изготовления, угол контакта из двух контрастных субстратов могут быть измерены. Рисунок 2 иллюстрирует изменения, которые происходят в процессе активации чип. Вполне вероятно, однако, что конкретные клей и отталкивания белковые компоненты в сыворотке в конечном счете, позволит Parylene узором чип, чтобы приложить соответствующие цито-клеевые или цито-отталкивающим характеристики.

Все представительные результаты используются чипы с толщиной Parylene 100 нм, хотя мы успешно рисунком с использованием как более толстые и более тонкие слои Parylene. Важно, что это фотолитографии травление методика позволяет значительно больший трехмерный контроль конфигурации Parylene, чем показано здесь. Например, используя комбинацию фотошаблонов, можно создать Parylene области смешанного толщины. Это открывает путь к созданию клеточных культур с определенной трехмерной топографии, выходящие за рамки просто диктуют регионах клеточной адгезии / отталкиванияСион, потенциально предлагая средства интеграции микрофлюидных каналов в конструкции.

Как показано, однако, это рисунка платформа не универсально эффективны для разных типов клеток. Различные клеточные линии, с их разнообразными клеточной адгезии профилей молекулы, что неудивительно себя по-разному при культивировании на этой платформе. Мы еще не определили ключевые компоненты в сыворотке, ни бесплатные клеточную мембрану рецепторы, которые лежат в основе этой клеточной паттерна платформу. Это в будущем обещает расширить его полезность и специфичность. Например, "не-паттерна 'клеточная линия может быть генетически модифицированы, чтобы выразить необходимой адгезии и таким образом способствовать паттерна.

Materials

Layout editor software package	e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html		Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture
Bespoke photo mask	e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com		Either fabricate in-house of facilities exist or commision
3" Silicon wafers	e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com
Atmospheric horizontal furnace	e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com		For oxidising silicon wafer
Small spot spectroscopic reflectometer	e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/		To measure depth of silicon dioxide layer
Silane adhesion promoter	e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/	1076730050	Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition
Parylene-C	e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010	SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/	Model PDS2010
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter	e.g. SpiChem, www.2spi.com
Automated track system for dispensing photoresist on wafers.	e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,		Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.  Pre-bake oven cures the resist.
Photo-resist: Rohm & Haas	Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/	SPR350-1.2 positive photo-resist
Phot-mask aligner	e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com
Microchem MF-26A developer	Microchem MF-26A developer, www.microchem.com		Removes exposed reogions of photoresist
Plasma etch system	e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk		Removes exposed regions of parylene
Wafer dicing saw	e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp
Acetone	e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/	A929-4	To wash off residual photoresist
30% Hydrogen Peroxide	e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com	H1009
98% Sulphuric Acid	e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com	435589
Fetal Bovine Serum	Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com	10437	Standard chip activation.
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com	14170