Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Summary

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Abstract

In diesem Protokoll wird ein Verfahren, um dendritische Zellen (DC) und Epithelzellen (TEC) von dem menschlichen Thymus isolieren. DC und TEC sind die wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen (APC)-Typen in einem normalen Thymus gefunden, und es ist bekannt, dass sie unterschiedliche Rollen während Thymus-Auswahl zu spielen. Diese Zellen werden in unterschiedlichen Mikroumgebungen im Thymus lokalisiert und jeweils APC Typ macht nur einen geringen Population von Zellen. Die Biologie dieser Zelltypen weiter zu verstehen, ist die Charakterisierung dieser Zellpopulationen sehr wünschenswert, aber wegen ihrer niedrigen Frequenz, die Isolierung von jeder dieser Zelltypen erfordert ein effizientes und reproduzierbares Verfahren. Dieses Protokoll Details eine Methode für die Charakterisierung von verschiedenen zellulären Eigenschaften Zellen zu erhalten. Thymusgewebes mechanisch aufgeschlossen und nach verschiedenen Schritten des enzymatischen Verdau wird das erhaltene Zellsuspension mit einem Zentrifugationsschritt Percoll-Dichte angereichert. Für die Isolierung von myeloischen DC (CD11c <sup> +)-Zellen von geringer Dichte Fraktion (LDF) durch magnetische Zellsortierung immunoselected. Anreicherung von TEC Populationen (mTEC, cTEC) durch Verarmung der hämatopoetischen (CD45 ^{hallo)-Zellen} von geringer Dichte Percoll Zellfraktion wodurch ihre anschließende Trennung mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) unter Verwendung spezifischer Zellmarker erreicht. Für verschiedene Downstream-Anwendungen können die isolierten Zellen verwendet werden.

Introduction

Der Thymus ist das Organ, in dem T-Zell-Entwicklung auftritt. Seine relative und absolute Größe mit dem Alter abnimmt, wenn sie teil sukzessive durch Fett ersetzt, obwohl Thymusaktivität noch im Alter festgestellt werden. Seine Bedeutung für die Immunantwort wurde in den frühen 1960er Jahren ^ein demonstriert.

Die T-Zell-Repertoire ist durch die Wechselwirkung der T-Zell-Rezeptoren, die mit Peptid-MHC-Komplexe auf unterschiedliche Arten von Thymus-APC, die das Überleben oder Tod Signale zu entwickelnden T-Zellen, was zu einer funktionellen und weitgehend selbst tolerant T-Zell-Repertoire ^{2 vorzusehen} geformt.

Etwa 98% der Zellen im menschlichen Thymus-T-Zellen entwickeln sich als Thymozyten bezeichnet. Die restlichen 2% bestehen aus einer Reihe von verschiedenen Zelltypen, einschließlich einer Vielzahl von TEC (kortikalen Mark, subkapsuläre), myeloide und plasmazytoiden DC (MDC, PDC), Makrophagen, B-Zellen reifen Umlauf-T-Zellen, Granulozyten, fibroblasts, Endothelzellen und Epithelzellen seltenen Zellen mit einem Expressions Phänotyp ähnlich derjenigen Zellen aus anderen Geweben, wie Muskel, Nervenzellen und respiratorischen Epithels (Abbildung 1). Davon TEC und DC sind die wichtigsten Arten von APC in einem normalen Thymus gefunden. In den letzten Jahren ist die Reinigung dieser APC-Typen für Kultur und molekularen Charakterisierung mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Aufgrund ihrer niedrigen Frequenz, Isolierung jeder dieser Zelltypen für eine detaillierte Analyse erfordert eine effiziente, reproduzierbare und kostengünstiges Verfahren. Die hier vorgestellte Methode ist eine Modifikation von bisher veröffentlichten Studien ^3,4.

Wie bei jedem anderen Gewebe können Zellgewinnung aus dem Thymus von enzymatisch Disaggregation der Zell-Zell-und Zell-Matrix-Interaktionsnetzwerke, um eine Suspension von Einzelzellen zu erhalten, erreicht werden. Es gibt bestimmte Parameter, wie gut Dissoziation Effizienz, Zellausbeute, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Aufrechterhaltung des Zell surface Marker, die von entscheidender Bedeutung sind, und müssen für die erfolgreiche Isolierung dieser seltenen Zellpopulationen optimiert werden.

In diesem Protokoll wird Trennung von DC und TEC Teilmengen, indem eine Einzelzell-Suspension aus dem Gewebe durch mechanische Zerstörung und enzymatischen Verdau durchgeführt. Wir verwenden Collagenase aus Clostridium histolyticum A, die ein ausgewogenes Verhältnis von verschiedenen Enzymaktivitäten hat, um die native Kollagen, die das Gewebe zusammenhält brechen. DNase I in der Enzymlösung enthalten, um die Zellaggregation durch freie DNA von toten Zellen zu reduzieren (Thymozyten sind sehr empfindlich). Wir bieten auch einen alternativen Ansatz zu den typischen enzymatische Verdauung Gewebe mit mechanischen und enzymatischen Gewebebehandlung durch eine Gewebe Dissoziator unterstützt. Die Einzelzellsuspension wird dann in einer einzigen Percoll-Dichte-Zentrifugation zur Anreicherung der Fraktion mit niedriger Dichte (LDF) von Zellen unterzogen. Von diesem Teil der Zellen kann durch Färbung DC f isoliert werdenoder DC-Oberflächenmarker (dh CD11c ⁺⁾ und unter Verwendung magnetische Trennung oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Im Gegensatz zu den lymphoiden Zellen, die große Mehrheit der Zellen in der Thymusdrüse, nicht TEC nicht exprimieren CD45 auf hohem Niveau, jedoch sind positiv für das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM. cTEC aus Mark TEC durch den Ausdruck eines noch nicht definierten Antigen durch die CDR-2 (kortikale dendritischen Retikulozyten-2)-Antikörper ^4,5 und etwas niedriger EpCAM-Expression erkannt unterschieden werden. Der Differenz Co-Expression von EpCAM und CDR2 ermöglicht die effiziente Isolierung dieser TEC Teilmengen über Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung ^6.

Die hier vorgestellte Protokoll ist für den menschlichen Thymus-Gewebe optimiert. Die Dauer des Verfahrens hängt von der Menge des Gewebes und der Fähigkeit der Versuchs sowie der Geschwindigkeit des Zellsortierer, wenn FACS-Sortierung verwendet. Normalerweise kann das Protokoll für die Isolierung von DC in 5 abgeschlossen-6 H und für die Isolierung von TEC in 8-10 Std. Die Trennung von DC-und TEC Teilmengen aus Thymus-Gewebe ist an der Zeit empfindlich. Je schneller die Isolierungsverfahren, die besser der Zustand der Zellen. Schließlich können die isolierten Zellen für weitere Untersuchungen, wie Vergleichsstudien von mRNA und Proteinexpression, PCR-Experimente, Proteinisolierung, molekularen Charakterisierung (dh Transkriptom, Mikro-RNA-Analyse) als auch Zellkultur ⁶ verwendet werden.

Ethikerklärung

Um in der Lage, mit der menschlichen Thymusgewebe arbeiten muss der Forscher der Zustimmung der lokalen Ethikkommission oder zuständigen Behörden sowie eine fundierte schriftliche Zustimmung der Spender (oder in der Regel seine Eltern, zu erhalten, da Gewebe wird in der Regel von minderjährigen erhalten Kinder). Darüber hinaus sollten alle menschlichen Gewebe als potenziell infektiös und sollten geeignete Maßnahmen ergriffen werden, wie die Arbeit mit Handschuhen, etc. behandelt werden.

Protocol

1. Vorbereitung der Werkzeuge, Enzym-Lösungen und Puffer

Führen Sie die folgenden Schritte präparative vor Beginn des Protokolls.

1. Werkzeuge
   Sauber, trocken und Autoklaven werden die folgenden Tools und halten sie in einer sterilen Verpackung bis zur Verwendung.
   1. Kleine scharfe Schere entweder mit gebogenen oder geraden Tipps zum Schneiden des Thymus Gewebe. Kleine gebogenen Pinzette mit geriffelten Spitzen für die Behandlung des Gewebes.
   2. 50 ml Oak Ridge Zentrifugenröhrchen, PC, für den Zentrifugationsschritt Percoll-Dichte.
2. Enzymlösungen
   Bereiten Sie die Collagenase / DNase-I-Enzym mischen (2 mg Collagenase / ml und 0,1 mg DNase I / ml) wie folgt:
   1. Man löst 500 mg des lyophilisierten Collagenase A (Roche) in 250 ml RPMI 1640 einfarbigen (FCS), um eine 2 mg / ml Collagenase-Lösung zu erhalten. Collagenase ist ziemlich schwer zu lösen, so empfiehlt es sich, einige Zeit auf einem Rollenschüttler bei RT verlassen.
   2. Lösen Sie 100 mg DNase I (Roche) in10 ml steriles destilliertes Wasser. 2,5 ml-Aliquots bei -20 ° C gelagert werden Fügen Sie 2,5 ml der 10 mg DNase I-Lösung in der 2 mg Collagenase eine Lösung.
   3. Sterilfilter der Collagenase / DNase-Mix mit einem Stericup Filtereinheit (0,22 um). Speicher in 10-20 ml-Aliquoten bei -20 ° C bis zur Verwendung.
3. Puffer und Lösungen
   1. 1,5 M NaCl Lager Lösung: NaCl in destilliertem sterilem Wasser zu einer endgültigen Konzentration von 1,5 M. Die Lösung wird durch einen 0,22 um Filter und Speicher bei RT.
   2. 10x MACS Puffer: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-frei),} enthaltend 5% BSA und 20 mM EDTA. Sterilfilter die Lösung mit einem 0,22 um Filter und bei 4 ° C Vor der Verwendung bereiten eine 1x-Lösung durch Verdünnen des 10fach in kaltem sterilem 1x PBS 1x.
   3. FACS-Puffer: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-frei),} enthaltend 1% BSA und 0,02% NaN _3.
   4. FACS-Puffer für Zellsortierung: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg

2. Präparation des Gewebes

Die Verarbeitung der Gewebe sollte mit sterilen Reagenzien und Arbeit in einer Sterilbank durchgeführt werden. Bevor das Verfahren beginnt, bereiten die folgenden Reagenzien und Geräte:

1. 1. Wärmen Sie die folgenden auf RT: RPMI 1640 Komplettmedium (RPMI 1640, 10% Fetales Kälberserum, 1% Pen / Strep), RPMI 1640 schlicht, Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-freiem} PBS und 2x Collagenase / DNase Enzymlösung.
   2. Warm Wärmebrutschrank mit Dreheinheit auf 37 ° C und kühlen Festwinkelrotor Zentrifuge auf 4 ° C
   3. Bereiten Sie eine Box mit Eis.

Hinweis: Die Dauer dieses Schritts ist abhängig vom Zustand und der Größe des Gewebes. Etwa 20-30 min ist ausreichend Zeit für eine mittelgroße Stück ti benötigtUSGABE in gutem Zustand (~ 5 cm in der Breite).

2. Zeigen Gewebe in einer Petrischale mit sterilem PBS und abspülen Restblut.
   1. In frischem PBS, um Gewebe von Trocknung und mit Pinzette und Schere reinigen das Gewebe von Blutgerinnseln, Binde-und Fettgewebe und einer Komponente, die nicht gesund aussieht verhindern.
   2. Achten Sie darauf, nekrotischen Gewebes, die die Menge von Schutt erhöhen zu entfernen.
   3. Nach der Reinigung, wiegen Gewebe als Referenz.
   4. Schneiden Sie das Gewebe in ca. 1 cm ³ Stücke / Blöcke. Fügen Sie genug PBS, um das Gewebe zu decken.

Anmerkung: Für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sollte Gewebe in Stücke von einheitlicher Größe geschnitten werden.

3. Mit dem Rücken einer sterilen Spritze (10-20 ml) gelten Druck (nicht zu kräftig oder längerer) auf die Thymus-Gewebestücke. Dieses Verfahren wird den Großteil der Thymozyten zu entfernen, damit die Gewebevolumen zu reduzieren, um später verdaut werden. Führen Sie diesen Schritt auf Eis und arbeiten schnell.
4. Die Lösung wird sichtbar trübe werden als Thymozyten freigegeben werden. Rühren Sie die Schale vorsichtig und dann mit Hilfe einer 5 ml Pipette oder einem Glassauger entfernen Sie den Überstand, der die Thymozyten kümmert sich nicht um die Gewebestücke versehentlich abzusaugen.

Tipp: Eine sterile Zellkulturschaber können alle Gewebestücke auf einer Seite der Schale zu konzentrieren, dann kippen die Schale (45 °-Winkel) und saugen Sie den Überstand werden. Ersetzen mit frischem PBS und wiederholen Sie den Vorgang, bis der Überstand ist relativ transparent. Führen letzten Waschen mit RPMI Ebene.

5. Mince Gewebestücke mit einer scharfen Schere (so fein wie möglich, sollte zumindest Fragmente 2-4 mm sein). Die Fragmente sollte klein genug, um eine 5-ml-Pipette einzugeben.

3. Herstellung von Einzelzellsuspension von Thymus Tissue

HierZwei alternative Ansätze für diesen Schritt beschrieben. Der erste Ansatz beschreibt eine typische enzymatische Verdauung Gewebe (Abschnitt 3.1), während die zweite besteht aus mechanischen und enzymatischen Gewebebehandlung durch eine Gewebe Dissoziator (Abschnitt 3.2) unterstützt.

Dieses Protokoll ist für die Verarbeitung von Gewebeproben mit einem Gewicht von 5 g optimiert. Für größere oder kleinere Gewebeproben, passen Enzymmengen.

3.1 Typische enzymatische Verdauung Gewebe, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten

1. Zeigen püriert Gewebe in 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Collagenase / DNase-Lösung pro 5 g Gewebe. In RPMI schlicht um ein Gesamtvolumen von 20 ml zu erhalten.

Hinweis: In einem 50-ml-Röhrchen verdauen bis 10 g Gewebe. Stellen Enzym Volumen entsprechend.

2. Inkubieren des Gewebes Suspension für 40 min bei 37 ° C unter langsamer Rotation in einem thermischen Inkubator.

Hinweis:

3. Die Enzymlösung wird trüb wie Zellen werden in der Veröffentlichung. Am Ende der Verdauung, Zentrifugenröhrchen bei 110 x g für 2 min, um Gewebefragmente zu sedimentieren.
4. Sammeln Stand aus diesem Verdauung Runde. Pellet die Zellsuspension für 10 min bei 400 x g. Absaugen des Überstandes und Resuspension Zellen in 10-50 ml RPMI Komplett abhängig von der Größe des Zellpellets.
5. Halten Zellsuspension in 37 ° C-Inkubator mit dem Deckel lose.
6. Wenn größere Zellzahlen erwünscht sind, kann der Schritt zur Digestion mit den restlichen Gewebestücke wiederholt werden und der erste und der zweite verdauen gepoolt. Auch wenn TEC sollten isoliert werden zwei Runden Verdaus durchgeführt werden sollte.
7. Ein Aliquot der Zellsuspension in Trypanblau (1:10-1:100) und zählen lebensfähigen Zellen mit einer Zählkammer. Halten Zellen bei 37 ° C in den Brutschrank, bis bereit, auf die Percoll Dichte-Zentrifugation (Abschnitt 4) fort. Nachfolgende Trennung von DC-Untergruppen (Abschnitt 5) wird aus diesen Zellen durchgeführt werden.

Hinweis: Thymus-Gewebe können in ihrer Zusammensetzung variieren, insbesondere mit dem Alter, die die Verdauung und die Effizienz der Erzeugung einer Einzelzellsuspension beeinflußt.

9. Für die anschließende Isolierung von Thymus-Epithelzellen (TEC) eine dritte Runde der enzymatische Verdauung benötigt wird. Resuspendieren Gewebereste in 10 ml frischem Collagenase / DNase-Lösung plus 10 ml RPMI schlicht und fügen Trypsin / EDTA (1:50 von 2,5% Aktien) in der Lösung.
10. Inkubieren bei 37 ° C für 40 min unter leichtem Rotation. Während der letzten 10 - 15 min der Inkubation hinzugefügt FCS (1:5), um die Aktivität von Trypsin zu neutralisieren.
11. Zentrifugieren bei 110 × g für 2 min bei RT, um die Gewebestücke zu sedimentieren.

12. Sammeln Sie die Zellüberstand und entsorgen Sie die Gewebefragmente sedimentiert.
13. Zentrifugieren des Zellüberstands bei 400 g für 10 min. Absaugen des Überstandes und resuspendieren Zellpellet in RPMI komplett.

Tipp: Die Zellpellets sind sehr locker, so achten Sie bei Verwerfen / Absaugen Stand.

14. Graf lebensfähigen Zellen mit einer Zählkammer. Legen Sie die Zellen in einer 37 ° C-Inkubator, bis Sie fortfahren, um die Trennung (Abschnitt 4) PERCOLL. Nachfolgende Voranreicherung von TEC-Zellen durch Depletion von CD45 ^hallo Zellen aus diesen Zellen (Abschnitt 6) durchgeführt werden.

3.2 Mechanische und enzymatische Gewebebehandlung durch eine Gewebe Dissoziator unterstützt

7,8 dissoziieren.

1. Übertragungs 5 ​​g zerkleinerte Gewebe Stücke (Schritt 2.5) in eine C-Rohr, das 10 ml Collagenase / DNase-Lösung.
2. Passen C-Rohr auf das Gewebe Dissoziator und Run-Programm m_spleen_02 (10 sec). Wiederholen Sie dieses Programm 4-5x (40-50 s).
3. Inkubieren mit leichter Rotation für 20 min bei 37 ° C.
4. Zentrifugieren bei 110 × g für 2 min bei RT.
5. Sammeln Überstand und gehen Sie wie in Schritt 3.1.4. 10 ml frisch Collagenase / DNase-Lösung.
6. Passen C-Rohr auf das Gewebe Dissoziator und Run-Programm m_spleen_01 (56 sec).
7. Inkubieren bei 37 ° C für 20 min unter leichtem Rotation.
8. Zentrifugieren bei 110 × g für 2 min bei RT.
9. Kol.T-Zell-Überstand und die Zellsuspension pelle für 10 min bei 400 x g. Gehen Sie wie in Schritt 3.1.4.
10. Wie in 3.1.9 beschrieben, eine dritte Runde der Verdauung ist für die anschließende Isolierung von Thymus-Epithelzellen (TEC) benötigt. Dazu resuspendieren Gewebereste in 10 ml frischem Collagenase / DNase-Lösung sowie Trypsin / EDTA (1:50 Verdünnung der Lager 2,5%)
11. Inkubieren bei 37 ° C für weitere 20 min unter leichtem Rotation. In FCS (1:5) und Inkubation für weitere 10 min.

Hinweis: Mit diesem Ansatz nach diesem letzten Schritt der Verdauung wird das Gewebe in der Regel vollständig dissoziiert und keine unverdauten Gewebefragmente eingehalten werden.

12. Gehen Sie wie in den Schritten 3.1.11-3.1.14.

4. Anreicherung von Zellen unter Verwendung von LDF Percoll-Dichte Trennung

Nach der enzymatischen Verdauung des Gewebes werden die Gesamt Thymus Einzelzellsuspensionen auf eine einzige Percoll-Dichte unterworfen centrifugatIonen Schritt für die LDF Zellen anzureichern. Die LDF von Zellen ist sehr für APC bereichert. DC-und TEC werden in diesem Teil der Zellen nachgewiesen.

1. Benutzen Sie aus der ^1. und ^2. für MDC-Isolierung verdaut erhaltene Zellsuspension (gepoolte Zellen, siehe Schritt 3.1.8) oder ^3. Digest (für TEC Isolierung) (3.1.14). Centrifuge Einzelzellsuspension von jedem Schritt der Verdauung bei 400 g für 10 min erhalten.
2. Bereiten Sie eine Percoll-Lösung mit einer endgültigen Dichte von 1,07 g / ml während dieser Waschschritt (siehe Beispiel unten in der Tabelle).

   Herstellung der Percoll-Lösung auf eine Enddichte von 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
   Rohrnummer	1	2	3	4
   Das unverwässerte Percoll (ρ = 1,130) (ml)	2,96	5,92	8,88	11.84
   1,5 M NaCl (ml)	0,6	1,20	1.8	2.4
   destilliertes H 2 O (ml)	2,44	4,88	7,32	9,76
   Volumen der letzten Arbeitsverdünnung	6 ml	12 ml	18 ml	24 ml

3. Die Anzahl der Percoll Rohre hängt von den Zellzahlen in den Schritten 3.1.8 und / oder 3.1.14 bestimmt. Kombinieren Sie die sterile Lösungen und gründlich mischen. Für eine optimale Isolation, können 0,6-1 x 10 ⁹ Zellen pro Röhrchen Percoll geladen werden. Kombinieren Sie die sterile Lösungen und gründlich mischen.

Tipp: Percoll ist lichtempfindlich und außerdem sollte es kalt gehalten werden. Vorbereitung der ersten Mischung, die das NaCl und H ₂ O (RT) und unverdünnt Percoll zuletzt, kurz vor dem Resuspendieren der Zellen in der Percoll-Lösung.

Zelt "> Hinweis: Percoll-Dichte kann zwischen verschiedenen Lieferanten und Chargen variieren Ist die Dichte der unverdünnten Percoll-Lösung nicht gleich 1,130 g / ml, verwenden Sie die vom Hersteller gelieferten Anweisungen, um die genauen Beträge der Percoll und H ₂ O berechnen erforderlich, um eine endgültige Dichte von 1,07 g / ml erhalten.

4. Resuspendieren bis zu 1 x 10 ⁹ Zellen in 6 ml der zubereiteten Percoll-Lösung (ρ = 1,07), mischen ausreichend, um eine homogene Suspension zu erhalten, und in ein 50 ml Oak Ridge Polycarbonat Schraubdeckel-Zentrifugenröhrchen.
5. Schicht sorgfältig mit 30 ml RPMI-Voll pro Röhrchen mit einer Pipette auf der Oberseite der Percoll-Lösung / Zellsuspension. Legen Sie das Medium langsam, so dass es auf der Oberseite der Suspension bleibt und kümmern sich nicht um die Schicht zu stören.
6. Wiegen Sie die Rohre, um sicherzustellen, dass sie gleiche Gewichte, so dass sie während der Zentrifugation ausgeglichen sind. Wenn sie es nicht sind, sorgfältig Medium mehr hinzufügen, um die leichtere Rohr (unter sterile Bedingungen).
7. Sorgfältig die Rohre zu einer vorgekühlten Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor, und Spin-Transfer bei 3.500 × g für 35 min bei 4 ° C mit der Bremse aus. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur in der Zentrifuge nicht höher als 4 ° C.
8. Röhren entfernen aus der Zentrifuge und sorgfältig sammeln die angereicherte APC, an der Interphase zwischen Percoll und Medium (Low-Density-Fraktion) gefunden von jedem Rohr mit einer sterilen Pasteur-Pipette. Übertragungszellen in einem 50 ml Röhrchen mit kaltem RPMI komplett. Füllen Sie das Rohr, um das restliche verdünnte Percoll.
9. Zentrifugieren der Zellsuspension für 10 min bei 300 × g bei 4 ° C. Überstand verwerfen und das Waschen wiederholen.
10. Zellpellet in mittleren und bestimmen die Zellzahl (unter Verwendung von Trypanblau und einer Zählkammer). Nach unserer Erfahrung ist der Prozentsatz der LDF-Zellen etwa 2-20% des nach Enzymspaltung gewonnenen Gesamt-Einzelzellsuspension. Eine typische yield von Low-Density-angereicherten Zellen (Thymus von einem jungen, Bereich 1 Tag-2 Jahre) ist 1x10 ⁸ Zellen pro 1 x 10 ^9, was einer 10% der gesamten Einzelzellsuspension Zellen.

Hinweis: In dieser Phase können Sie beobachten, dass Zellen in der Suspension aggregiert (vor allem mit Proben von Kindern älterer Alter). Zellklumpen sind Anzeichen von Zelltod und das Ergebnis aus der Auflösung von DNA aus den sterbenden Zellen, die Zellen zusammenkleben können. In einem solchen Fall fügen DNase I in der Probe (50 ug / ml) inkubiert und es bis zu 20 min bei RT (sanft invertiert alle 5 min), um die freie DNA-Molekülen verdauen.

5. Isolierung von Thymic mDC

APC nach Anreicherung (über Percoll-Trennung), MDC effizient von der LDF nach der ersten und zweiten Runde der enzymatischen Verdaus isoliert werden. Das folgende Protokoll ist eine modifizierte Version des magnetischen Zelltrennung zur Isolierung von MDC (CD11c

1. Zentrifuge APC angereicherten Zellen aus der aus den gepoolten ersten und zweiten enzymatischen Abbau bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren Zellpellet in 100 &mgr; l MACS-Puffer erhalten pro 10 ⁷ Zellen Einzelzellsuspension isoliert.
2. In 5 ul der CD11c-PE Antikörper pro 10 ⁷ Zellen.

Hinweis: Titration Experimente sind für optimale Ergebnisse empfohlen.

3. Gut mischen und die Proben für 15 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt.
4. Waschen der Zellen durch Zugabe von 1-2 ml von MACS-Puffer pro 10 ⁷ Zellen und Zentrifugation bei 300 × g für 10 min.
5. Absaugen des Überstandes und Resuspendieren bis zu 10 ^7-Zellen in 80 ul MACS-Puffer.
6. In 20 ul Anti-PE-Microbeads pro 10 ⁷ Zellen.
7. Gut mischen (nicht vortexen) und Inkubation für 15 min bei 4 ° C vor Licht geschützt.
8. Wiederholen Sie, wie in Schritt 5.4. Resuspendieren bis 10 ⁸ Zellen in 500 &mgr; l Puffer.
9. Ggf. Filterzellsuspension unter Verwendung eines 40 &mgr; m-Zellsieb um Schmutz und Zellaggregaten, die die Strömung der Säule verstopfen können, zu entfernen.
10. Verwenden Sie eine Spalte LS seit Thymus Zellsuspensionen besser fließen durch die LS-Säulen. Bereiten LS Spalte folgenden Anweisungen des Herstellers. Pipette Zellsuspension langsam in der Säule vermieden Erzeugen von Blasen. Verwenden Sie eine Spalte für jeweils 1 x 10 ⁸ Zellen.
11. Nach den Anweisungen des Herstellers Waschkolonne. Entfernen Spalte aus Magnet und legen Sie sie in ein steriles 12 ml-Rundrohr Polypropylen. 3 ml MACS-Puffer in die Säule und Sammeln magnetisch markierten Zellen durch Einführen und fest drückt den Kolben in die Säule.
12. Sammeln Sie die eluierte Fraktion, die die CD11c ⁺ mDC und Zentrifuge bei 400 g für 6 min.
13. Bestimmen der Zellzahl und bestätigen Reinheit der ausgewählten Zelle populatiauf durchflusscytometrisch. Empfohlene Marker umfassen CD45, CD11c und HLA-DR.

Hinweis: CD11c ⁺ mDC kann auch unter Verwendung eines FACS-Sorter isoliert werden.

6. Anreicherung von CD45 ^{lo / neg} Zellen für die Zellsortierung von TEC

Für die Isolierung von TEC können Zellen vor, angereichert durch Depletion von CD45-Zellen mit CD45 ^hallo Mikrokügelchen, um durch Zellsortierung Beschleunigung ihrer Isolation.

Benutzen Sie aus dem ^3. Verdauung Schritt (3.1.14) erhalten und anschließend durch Zentrifugation abgetrennt Percoll Zellsuspension.

1. Pro 10 ⁷ Zellen Zentrifuge Zellsuspension bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren Zellpellet in 80 &mgr; l MACS-Puffer.
2. Verwenden CD45 Microbeads bei 1/3 der empfohlenen Menge (6,7 &mgr; l) pro 10 ⁷ Zellen.

Hinweis: Durch die Verwendung einer geringeren Mengeder Mikrokügelchen wir vor, eine Bereicherung für beide Zellen CD45 und CD45 ^{neg lo-Zellen.} Titration wird für optimale Ergebnisse empfohlen.

3. Gut mischen durch leichtes Schwenken der Röhre (Nicht Vortex Do) und Inkubation für 15 min bei 4 ° C
4. Wasch ungebundene Mikrokügelchen durch Zugabe von 10 ml von MACS-Puffer und Zentrifuge für 10 min bei 300 × g bei 4 ° C. Absaugen des Überstandes.
5. Resuspendieren bis 10 ⁸ Zellen in 500 &mgr; l Puffer.
6. Ggf. Filterzellsuspension unter Verwendung eines 70 &mgr; m-Zellsieb um Schmutz und Zellaggregaten, die die Strömung der Säule verstopfen können, zu entfernen.
7. Verwenden Sie eine Spalte LS seit Thymus Zellsuspensionen besser fließen durch die LS-Säulen. Bereiten LS Spalte folgenden Anweisungen des Herstellers. Pipette Zellsuspension langsam in der Säule vermieden Erzeugen von Blasen. Verwenden Sie eine Spalte für alle 10 ⁸ Zellen.
8. Sammeln unmarkierten Zellen (Flow-Through-und Waschungen) mitdie CD45 ^{lo / neg} Zellfraktion und waschen Spalte folgenden Anweisungen des Herstellers.
9. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren Zellpellet in sterile FACS-Puffer, um die Zellzahl zu bestimmen und zur Zellsortierung Färbung.

7. Flecken Zellen für Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

1. Führen FcR Blockierung vor der Zellfärbung, um nicht-spezifische Antikörperbindung zu reduzieren. Inkubieren Zellsuspension mit gepoolten Human-Immunglobuline Lösung für 15 min bei RT. Diese Reagenzien sind im Handel erhältlich (zB Gammunex 10% ige Lösung).
2. Waschen der Zellen durch Zugabe von kaltem sterilen FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 × g für 6 Minuten bei 4 ° C.
3. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in kaltem sterilen FACS-Puffer. Bereiten 5 Proben gemäß dem folgenden Beispiel:
   

   * Scc, Einzelfarbsteuerung

   Inkubieren Zellen mit Antikörpern für 30 min auf Eis im Dunkeln.
   Zweimaliges Waschen mit FACS-Puffer durch Zentrifugieren Zellen bei 400 × g für 6 Minuten bei 4 ° C.
   Einstellen der Zellkonzentration der Probe auf 1 × 10 ⁷ Zellen / ml (oder der Konzentration der Zellsortiereinrichtung empfohlen) mit sterilen FACS Puffer für Zellsortierung (dh ohne NaN ₃₎ sortiert werden.
   Pass Zellprobe durch eine 70 um Zell Sieb, um alle Zellklumpen, die das Durchflusszytometer während der Sortierung verstopfen können, zu entfernen.
   Resuspendieren Kontrollproben in 200-400 ul Puffer. Halten Röhrchen auf Eis und vor Licht geschützt.
   Bereiten Sammelröhrchen mit Medium.

   Hinweise:

   • Führen Titration der Antikörper für eine optimale Färbung.
   • In einer Probe zum Sortieren, kann bis zu 50 x 10 ⁶ Zellen in einem Gesamtreaktionsvolumen von gefärbten werden500 ul.
   • Färbungen der Probe in 5 ml Falcon Polystyrol-Rundbodenröhrchen sortiert werden. Die einzelnen Farbsteuerungen können in separaten Wells einer 96-Well-Platte gefärbt werden.
   • Seit TEC Teilmengen sind selten Populationen, ist es ratsam, einen weiteren positiven Marker (von Hochfrequenz) für jedes Fluorochrom verwenden, um die Bestimmung der richtigen FACS-Einstellungen zu erleichtern und um sicherzustellen, dass Sie eine angemessene Entschädigung, wenn die Wahl der Fluorochrome Ausgleich erfordert. Zellen aus der CD45 ^+-Fraktion mit Marker wie CD45, CD3 oder CD8 für die verschiedenen Fluorochromen gefärbt und nach Färbung ungefärbten CD45 ^+-Zellen zu der Probe gegeben werden.

   8. Isolierung von TEC durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

   (MTEC) oder EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (cTEC) ^- TEC Teilmengen aus der CD45 ^{lo / neg-Fraktion} als EpCAM ^hallo CDR2 sortiert werden.

   1. Führen Sie das Beispiel with die ungefärbten Zellen und stellen Sie die Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht, um die Bevölkerung von Interesse in Waage legen. Einstellen der Spannung an jedem Detektor, so dass die Zellen sichtbar, aber in der weit linken Teil des Histogramms befinden.
   2. Führen Sie jede einzelne Probe und Bunt Entschädigung für jede Farbe ein.
   3. Nach dem Einstellen der Spannung und Ausgleich für die ungefärbten und gefärbten Einzelkontrollen führen Sie das Beispiel sortiert werden und die Verwendung Gating-Werkzeuge, um die Bevölkerung von Interesse zu definieren. Verwenden Sie eine breite vorn und Seitenstreuung Tor zur Einbeziehung aller Stromazellen Größen sorgen, während ohne Zelltrümmer.
   4. Auf den Punkt Grundstück mit CD45-Pacific Blue gegen Forward Scatter Tor auf den CD45 ^niedrig und CD45 ^neg Zellen.
   5. Wenden Sie dieses Tor zu einer EpCAM gegen CDR2 Punkt-Diagramm und bestimmen durch Gating die Bevölkerung, die sortiert werden.
   6. Nach Toren bestimmt worden sind, wählen Sie die Tore die Bevölkerung von Interesse enthält, und starten Sie die Sortierung.

   Anmerkung: Während des Sortiervorgangs, um die Zellen vom Kleben an den Seiten der Sammelröhre zu verhindern, kann das Rohr durch Befüllen mit 50% FCS in PBS vorbeschichtet und bei RT für 30 min inkubiert werden. Entsorgen Sie die Beschichtungslösung vor der Zugabe Sammlung Medien.

   Representative Results

   Als Ausgangsmaterial in diesem Protokoll verwenden wir Thymusgewebe von Kindern unterziehen Korrektur kardiovaskulären Chirurgie (Abteilung für Thorax-und Kardiovaskuläre Chirurgie, Universitätsklinikum Tübingen) nach der Einwilligung und unter institutionellen Richtlinien erhalten entfernt. Dieses Material kann verworfen stark in der Größe von 2 bis 30 g oder mehr variieren. Die Anzahl von MDC und TEC Teilmengen (cTEC und mTEC), die erhalten werden, hängt von der Größe als auch vom Alter des Thymus Gewebeprobe zur Isolierung verwendet.

   Figur 2 zeigt eine relativ große Gewebestück (~ 9 cm) aus einem sechsjährigen Kind erhalten. Ein wichtiger erster Schritt bei der präparativen dieses Protokolls ist die Reinigung des Gewebes von unerwünschten Teilen (weiße Pfeile).

   Thymus-Gewebe wurde behandelt, wie in den Abschnitten 2 und 3.1 des Protokolls skizziert, um eine Einzelzellsuspension, die mit einem einzigen Percoll Dichte-Zentrifugation abgetrennt s wurde erhaltenTEP Während die Einzelzellsuspension enthält ungefähr 3% der HLA-DR +-Zellen (Fig. 3A) nach Percoll Zentrifugation dieser Prozentsatz ist in der Fraktion mit niedriger Dichte (LDF) erhöht, großformatige Zellen enthält, um 15-40%, während die hochdichte Fraktion (HDF), im Wesentlichen gleichmäßige kleine Thymozyten besteht enthält praktisch keine derartigen Zellen (3B). Die Wertfraktion (LDF), die angereichertes APC wurde anschließend gesammelt und gewaschen, um Zellen zur Verwendung in anschließenden Isolierungsschritte zu sammeln.

   Während Thymus MDC ist von der Expression einer Anzahl von Oberflächenmarkern, einschließlich CD11c9, 10 identifiziert werden, pDC exprimieren Marker wie BDCA-2, BDCA-4, CD45RA und CD123 ^11,12. Nach Anreicherung der LDF-Zellen, beide Zelltypen bilden 2-10% dieser Fraktion, so dass ihre effiziente Isolierung auch in größerer Zahl, entweder durch magnetische Zellseparation oder Fluss Sortierung von CD11c ⁺ oder BDCA-4 ⁺⁶ Zellen.

   Abbildung 4 zeigt die effiziente Isolierung von CD11c ⁺ Zellen unter Verwendung der in Abschnitt 5 beschriebenen modifizierten magnetischen Zellseparation Protokoll. Nach der Isolierung, die Reinheit des CD11c ⁺ DC betrug 93%, wie durch Immunfärbung von isolierten Zellen etabliert. Im Durchschnitt ist die Gewinnung von isolierten CD11c ⁺ DC 5 x 10 ⁵ x 10 -5 ⁶ mDC pro 10 ⁹ gesamt Thymus-Zellen. Tabelle 1 zeigt Daten aus mehreren Einzel Thymus Proben unterschiedlichen Alters-und Gewebegewicht mit einer Reihe von Input-Single erhalten Zellsuspensionen sowie insgesamt LDF Nummern und die anschließende CD11c ^+-Ausbeute und Reinheit.

   In der APC-angereicherte Fraktion, nur etwa 0,5% der Zellen CD45 ^lo EpCAM ⁺ oder CD45 ^{+ neg.} EpCAM. cTEC und mTEC aus den trypsinverdauten CD45 ^{lo / neg} angereichert Stromazellen als EpCAM ^l sortiert werden o ⁺ CDR2 und EpCAM ^hallo CDR2 ^- jeweils wie in Fig. 5 gezeigt.

   
   Fig. 1 ist. Ein vereinfachtes Diagramm der zellulären Organisation und Zusammensetzung des menschlichen Thymus. Der Thymus aus Thymocyten, in verschiedenen Reifestadien, und ein heterogenes Mobilfunknetz bezeichnet als Thymus-Stroma-Bildung des Thymus Umgebung. Die wichtigsten Zelltypen des Thymus-Stroma sind mDC und pDC-, Epithel-Zellen (in zwei Hauptkategorien nach ihrer Lokalisation innerhalb der Läppchen unterteilt: kortikale und Mark) und Makrophagen Abkürzungen: DC, dendritische Zellen; MDC myeloischen dendritischen Zellen;. pDC, plasmazytoiden dendritischen Zellen; &PHgr;, Makrophagen, Mono, Monozyten; cTEC, kortikale Epithelzellen; mTEC, Mark Epithelzellen.

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   2. Ersten präparativen Schritt des Gewebes für die Einzelzellpräparation. Pfeile zeigen auf die unerwünschten Gewebeteile, die vor der Ausführung des Protokolls verworfen werden müssen.

   
   3. Reinigung von Thymus-APC. FACS-Analyse von verschiedenen Stufen des Reinigungsverfahrens. Einzelzellsuspensionen von Thymusgewebe wurden durch mechanische Zerstörung und Serien enzymatische Aufschlüsse erhalten und APC angereichert (LDF-Zellen) durch Percoll-Dichte-Trennung. Zellen vor (A) und nach (B) der Percoll-Dichtetrennung wurden mit HLA-DR-PE-Antikörper gefärbt, um für APC-Anreicherung überprüfen. Prozentbereich von HLA-DR +-Zellen in der Regel beobachtet wird, ist INDICAT hrsg.

   
   4. Isolierung von CD11c ⁺ mDC. Thymus Gewebe wurde mit Collagenase A / DNase I, um eine Einzelzellsuspension erstellen verdaut. CD11c ⁺ mDC nur einen geringen Bevölkerung der Einzelzellsuspension (0,6%). Nach Anreicherung der LDF-Zellen über Percoll-Dichtetrennung der prozentuale Anteil der CD11c ^+-Zellen erhöht, um ca. 9%. Die LDF-Zellen mit CD11c-PE-Antikörper markiert und anschließend isoliert mit magnetischen Kügelchen (anti-PE). Reanalyse der CD11c ⁺ Bevölkerung direkt nach der magnetischen Zellseparation durch FACS angegeben 93% Reinheit. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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   5. Anreicherung von CD45 ^{lo / neg} Zellen und die anschließende Sortierung von TEC Teilmengen. A) Repräsentative Dot-Plots, die Prozentsätze der CD45 negativ / niedrig Thymusstroma Zellen im Gesamteinzelzellsuspensionen vor und nach Percoll Dichtetrennung (9% und 16,2%, beziehungsweise). (mTEC) oder EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (cTEC) ^- B) Die LDF-Zellen wurde von CD45 ^hallo Zellen mit magnetischen Beads und die TEC Teilmengen aus der abgereicherten Fraktion als EpCAM ^hallo CDR2 sortiert erschöpft.

   Probe	Probentyp Antikörper	Handy-Nummer	Gesamtvolumen
   1. unbefleckt	Kontrolle		1 x 10 6	50 ul
   2.scc *-Pacific Blue	Kontrolle	CD45-Pacific Blue	1 x 10 6	50 ul
   3. scc-APC	Kontrolle	CD3-APC	1 x 10 6	50 ul
   4.scc-Alexa 488	Kontrolle	CD8-Alexa 488	1 x 10 6	50 ul
   5. Zellsortierung	Analyten	CD45-Pacific Blue EpCAM-APC CDR2-Alexa 488	10 x 10 6 x - 50 x 10 6	500 ul 10 × 10 6 Zellen/100 &mgr; l

   CD11c + mDC Frequenzen, Zell Ausbeuten und Reinheiten von verschiedenen Spendern
   Spender	Alter	Gewebegewicht	Insgesamt Zellen pro Probe	LDF Zellen pro Probe	CD11c+%	CD11c + pro Probe isoliert	CD11c + Reinheit
   1	5 Tage	7 g	1,45 x 10 9	9,5 x10 7	12,6	2,4 x 10 6	89%
   2	3 Jahre	15 g	2 x 10 9	6,5 x10 7	4.3	1,9 x 10 6	81%
   3	21 Tage	9 g	2,6 x 10 9	22 x10 7	10.3	3,6 x 10 6	93%
   4	6 Jahre	13 g	1,4 x 10 9	25,4 x10 7	4.2	5,7 x 10 6	82%
   5	5 Tage	6,5 g	1,3 x 10 9	16,2 x10 7	6	2,9 x 10 6	91%
   6	39 Tage	3 g	0,6 x 10 9	8 7 x10	3.4	1,3 x 10 6	80%

   Tabelle 1. Die Zahl der Gesamteinzelzellsuspension Zellen nach zwei Runden der Verdauung sowie Erträge von LDF-Zellen nach Percoll Trennung freigegeben werden für Isolierungen in Thymus Proben von sechs Personen unterschiedlichen Alters-und Gewebegewicht durchgeführt angezeigt. Frequenzen von MDC wurden mittels Durchflusszytometrie bestimmt auf der Basis auf CD11c-Expression in Gesamt LDF Zellen (APC angereichert). Ausbeute und Reinheit des CD11c ^+-Zellen nach der magnetischen Kügelchen Trennung für jeden einzelnen Spender dargestellt.

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll ist eine Modifikation des Protokolls durch Gotters et al ⁴ veröffentlicht. Kritischen Schritte in dem Protokoll sind der Zustand und die ursprüngliche Herstellung des Gewebes sowie der Percoll-Dichte-Trennung. Wir empfehlen dringend, das Gewebe so bald wie möglich nach der Entnahme zu verarbeiten. Es ist wichtig, schnell, aber gründlich zu arbeiten, wenn die Reinigung und das Schneiden des Gewebes. Während der in Schritt 2.3 beschrieben thymocyte waschen, ist es entscheidend, die richtige Balance bei Druck mit der Rückseite der Spritzenkolben auf die Gewebestücke als zu kräftigen und anhaltDruck kann die Stroma-Zellen schädigen finden. Layering das Medium auf der Percoll-Lösung / Zellsuspension ohne Störungen kann auch verlangen, etwas Übung. Nach Zentrifugation, ist es wichtig, alle Dichtefraktion Zellen niedrig, so schnell wie möglich aus dem Percoll-Schicht mit einer minimalen Menge von Percoll-Lösung zu sammeln.

DieGesamtzellausbeuten und relativen Zahlen APC kann sehr variabel sein (siehe Tabelle 1) und sind abhängig von der Geber (vor allem in Bezug auf Alter) und die präparativen Fähigkeiten des Experimentators. Für eine kurze Übersicht können Zellsuspensionen, die mit HLA-DR und / oder anderen Markern folgenden unterschiedlichen Schritte des Protokolls nach Wunsch gefärbt werden. Alle Antikörper für phänotypische Analyse sollte titriert werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Aufgrund der relativ geringe Häufigkeit von APC Typen im Thymus im Vergleich zu thymoctyes könnten größere Stücke Thymus erforderlich, wenn eine höhere Anzahl von isolierten Zellen erwünscht sind.

Wenn ein Gewebe Dissoziator ist im Labor verfügbar, wird dies erheblich beschleunigen Gewebeverarbeitung, aber beide hier beschriebenen Varianten gleich gut. Ein relativ häufiges Problem könnte Verklumpung der Zellen, vor allem während der Schritte zwischen der Trennung und Percoll MACS / FACS-Sortierung. In diesem Fall ist eine kurze DNase I digestion wie in dem Protokoll beschrieben wird in der Regel das Problem zu lösen. Da Thymusgewebes nacheinander von Fettgewebe während der Alterung, Thymi von älteren Spendern könnte etwas Fett, das am oberen Ende des Rohres nach dem Zentrifugieren der Einzelzellsuspensionen der verschiedenen Abbaustufen erreicht schwimmen enthalten wird ersetzt. In einem solchen Fall sollte Fett mit einer Pipette bevor das Protokoll entfernt werden. Für optimale Ergebnisse sowie Wirtschaft Gründen, die wir beraten, nicht nur die Antikörper, sondern auch die anti-PE-Mikroperlen titriert (§ § 5 und 6). Für die Isolierung von TEC aus Maus-Thymus, haben alternative Enzymmischungen beschrieben, um ^8,13 TEC Ausbeute zu verbessern, aber wir haben sie nicht mit menschlichem Gewebe getestet.

Grundsätzlich andere Thymus APC und Stromazellen wie B-Zellen und pDC können auch aus den LDF-Zellen (nach Kollagenase / DNase-Verdau und Percoll) mittels FACS / MACS-Sortierung, wenn die jeweiligen Marker bekannt sind, isoliert werden. Zum Beispiel für PDC BDCA-2-BDCA4 und CD123 als Marker wurden ^6,14 beschrieben. Wenn die Analyse oder Isolierung von Teilmengen thymocyte gewünscht wird, empfehlen wir die Verwendung der Zellen durch Quetschen (Schritt 2.3) veröffentlicht, da sind sie ganz rein und haben minimale Manipulation unterzogen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
RPMI 1640	PAA	E15-842
Dulbecco's PBS	PAA	H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold	PAA	A15-151
Bovine Serum Albumin	PAA	K41-001
Collagenase A	Roche	10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic	Roche	10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS	PAA	L11-001	stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit	Molecular Probes	A-10235
anti-human CDR2 (purified)	Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany		labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue)	Biolegend	304022
anti-human EpCAM (APC)	Miltenyi Biotec	130-091-254
anti-human CD11c (PE)	Miltenyi Biotec	130-092-411
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml)	GE Healthcare, Life Sciences	17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)	GIBCO	10977-035
Gamunex 10%	Tajecris-Biotherapeutics	G120052	1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter	Millex GS	SLGS033SS	Syringe driven
Stericup filter unit	Millipore	SCGPU05RE	Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes	Nalgene	3118-0050	50 ml
50 ml PP conical tubes	Becton Dickinson	352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes	Becton Dickinson	352058	FACS stainings
Cell strainer 70 μm	Becton Dickinson	352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)	Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor)	Kendro
Rotator REAX 2	Heidolph
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093 235	tissue dissociator