Ingénierie à base de fibrine constructions de tissu de myofibroblastes et application des contraintes et de déformation à Provoquer Organisation cellulaire et collagène (Re)
Summary
Ce système de modèle commence à partir d'un gel de fibrine myofibroblastes peuplée qui peut être utilisé pour étudier collagène endogène (ré) organisation en temps réel de façon non destructive. Le système de modèle est très accordable, comme il peut être utilisé avec des sources différentes de cellules, des additifs moyen, et peut être adapté facilement à des besoins spécifiques.
Abstract
teneur en collagène et de l'organisation dans le développement de tissus collagènes peuvent être influencés par des souches de tissus locaux et des contraintes de tissu. ingénieurs de tissus visent à utiliser ces principes pour créer des tissus avec des architectures de collagène prédéfinis. Une pleine compréhension des processus sous-jacents exactes de remodelage du collagène de contrôler l'architecture finale de tissu, cependant, est manquant. En particulier, on sait peu au sujet de l'orientation (re) des fibres de collagène en réponse aux changements des conditions de chargement mécaniques des tissus. Nous avons développé un système modèle in vitro, composé de bi-contraints myofibroblastes tête de série fibrine constructions, à élucider collagène orientation (re) en réponse à i) revenant biaxial à des conditions de chargement statique uniaxiaux et ii) chargement cyclique uniaxial de la bi-contraint constructions avant et après un changement de direction de chargement, avec l'utilisation du dispositif de chargement FX4000T flexcell. Imagerie confocale time-lapse est utilisé pour visualize collagène orientation (re) d'une manière non-destructive.
organisation de cellules et de collagène dans les constructions peuvent être visualisées en temps réel et un système de référence interne nous permet de délocaliser les cellules et les structures de collagène pour l'analyse time-lapse. Divers aspects du système de modèle peuvent être ajustés, comme source ou l'utilisation de cellules saines et malades cellule. Des additifs peuvent être utilisés pour élucider les mécanismes remodelage du collagène sous-jacent, par exemple en ajoutant MMP ou le blocage des intégrines. Forme et la taille de la construction peuvent être facilement adaptés à des besoins spécifiques, résultant en un système modèle très configurable pour étudier la cellule et du collagène (ré) organisation.
Introduction
Les tissus cardiovasculaires ont une fonction de charge importante. En particulier, le contenu et l'organisation des fibres de collagène dans la matrice extracellulaire contribuer aux propriétés porteuses et dominer la force globale de tissus 1. Dans l'ingénierie tissulaire conditionnement mécanique de la construction est utilisée – généralement composé d'(cyclique) des régimes rude épreuve – afin d'améliorer l'organisation des tissus et des propriétés mécaniques 2,3. Une bonne compréhension de l'organisation du collagène induite par contrainte dans des géométries complexes de tissus pour créer des tissus à l'architecture de collagène prédéfinie n'a pas encore été atteint. Ceci est principalement dû à notre connaissance limitée de remodelage du collagène dans les tissus en voie de développement. Les modèles existants donnent surtout des informations sur le résultat net final de remodelage du collagène avec l'utilisation des contraintes statiques 4-6. Ici nous fournissons un système modèle très configurable qui permet l'étude de collagène (ré) organisation d'une manière en temps réel, en 3D, sous l'influencede contrainte statique ou cyclique. Les constructions de tissus sont à base de fibrine, s'assurer que tous collagène dans la construction est endogène. organisation de cellules et de collagène dans les constructions est visualisée, et un système de référence interne nous permet de relocaliser les cellules et les structures de collagène pour l'analyse time-lapse. Dans ce protocole, nous allons décrire l'utilisation du système de modèle pour les cellules Saphena Vena humaines (HVSCs), puisque ces cellules sont connus pour leur meilleure production supplémentaire cellulaire de la matrice et la capacité de remodeler la matrice et notre usage établi dans les tissus cardiovasculaires ingénierie 7, sur la base sur les travaux de de Jonge et al. 8
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système modèle décrit des constructions de fibrine cellule de population a un grand potentiel pour l'étude des cellules et de collagène (ré) organisation (de Jonge et al. 15), par exemple, être utilisé à des fins d'ingénierie tissulaire. En utilisant la fibrine en tant que support de cellule initiale, après la dégradation de la fibrine, d'un tissu est créé avec des cellules et de la matrice endogène seulement. De cette façon, les cellules sont stimulées à ré…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été réalisée dans le programme de recherche des matériaux biomédicaux (BMM) Institut. BMM est cofinancé par le ministère néerlandais des Affaires économiques, de l'Agriculture et de l'Innovation. La contribution financière de la Hartstichting Nederlandse est grandement appréciée.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
Referências
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