Инженерные основе фибрина тканей Конструкции из Миофибробласты и применение ограничений и напрягаться, чтобы индуцировать клеточную и коллагена (Re) организации
Summary
Эта модель системы начинается с миофибробластного населенных фибрин гель, который может быть использован для изучения эндогенного коллагена (ре) организации в режиме реального времени в неразрушающим способом. Модель системы очень настраиваемый, так как он может быть использован с различными источниками клетка, средние добавки, и можно легко адаптировать к конкретным потребностям.
Abstract
Содержание коллагена и организацией в разработке коллагеновых тканях может быть под влиянием местных штаммов ткани и ткани ограничения. Ткань инженеры стремятся использовать эти принципы для создания тканей с заданными архитектуры коллагена. Полное понимание точного основные процессы ремоделирования коллагена для регулирования конечных архитектуры ткани, однако, отсутствует. В частности, мало известно о (пере) ориентации коллагеновых волокон в ответ на изменения в тканях механической нагрузки. Мы разработали системы в пробирке модель, состоящая из двухосной ограниченными миофибробластов семенами конструкций фибрина, для дальнейшего выяснения коллагена (пере) ориентации в ответ на I) возвращаясь к двухосной одноосные условиях статической нагрузки и II) циклического одноосного загрузка двум осям ограничен конструкций до и после изменения погрузки направление, с использованием загрузочного устройства Flexcell FX4000T. Покадровый конфокальной микроскопии используется для VIsualize коллагена (пере) ориентации в неразрушающим способом.
Сотовые и коллагена организации в конструкции могут быть визуализированы в реальном времени, и внутренняя система отсчета позволяет нам переехать клеток и коллагеновых структур для покадровой анализа. Различные аспекты модели системы можно регулировать, как и исходная сота или использование здоровых и больных клеток. Добавки могут быть использованы для дальнейшего выяснения механизмов основного ремоделирования коллагена, например, путем добавления ММР или блокирование интегринов. Форма и размер этой конструкции можно легко адаптировать к конкретным потребностям, в результате чего сильно перестраиваемой модель системы для изучения клеток и коллагена (ре) организации.
Introduction
Сердечно-сосудистые ткани имеют видное несущие функции. В частности содержания и организации коллагеновых волокон во внеклеточном матриксе способствовать несущие свойства и доминировать общей прочности ткани 1. В тканевой инженерии механических кондиционирования конструкцию используют – как правило, состоящей из (циклический) напряжение схемы – повышение организации ткани и механические свойства 2,3. Полное понимание деформационного коллаген организацией в сложной геометрии ткани для создания ткани с заданными архитектуры коллагена до сих пор не было достигнуто. Это происходит главным образом из-за нашего ограниченного знания ремоделирования коллагена в развивающихся тканях. Существующие модели основном дают информацию об окончательных результатах чистая ремоделирования коллагена с использованием статических деформаций 4-6. Здесь мы предлагаем тонкой настройке модель системы, которая позволяет исследовать коллаген (ре) организации в реальном времени способ, в 3D, под воздействиемстатической или циклической деформации. Ткань конструкты на основе фибрина, то, чтобы все коллагена в конструкции является эндогенным. Сотовые и коллагена организации в конструкциях визуализируется, и внутренней системе отсчета позволяет нам переехать клеток и коллагеновых структур для покадровой анализа. В этом протоколе мы опишем использование модели системы по правам Vena Клетки Saphena (HVSCs), так как эти клетки, как известно для повышения эффективности их внеклеточного матрикса и способность реконструировать матрицы и наших устоявшихся использования в инженерных сердечно-сосудистых тканей 7, основанная о работе де Жонж соавт. 8
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанная модель системы клеточного населенных конструкции фибрин имеет большой потенциал для исследования клетки и коллаген (ре) организации (де Жонж соавт. 15), например, быть использованы для целей тканевой инженерии. При использовании фибрин в качестве начальной яче…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было выполнено в исследовательской программе биомедицинских материалов (ВММ) института. BMM является cofunded от голландского министерства экономики, сельского хозяйства и инноваций. Финансовый взнос Hartstichting Nederlandse выражает искреннюю признательность.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
Referências
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
