שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור
Summary
נהלים מסורתיים לבידוד של קולגן סוג מסיס 1 (col1) דורשים על 10 ימים מהתחלה ועד הסוף בגלל incubations חיץ הארוך ומייגע resuspensions של סיבים. כאן, אנו מתארים אמצעים כדי לטהר col1 מביופסיות עורי קטנים בפחות מ 3 שעות.
Abstract
סוג מסיס קולגן 1 (col1) נעשה שימוש נרחב כמצע דבק לתרביות תאים ופיגום סלולארי ליישומי רגנרטיבית. מבחינה קלינית, חלבון זה נמצא בשימוש נרחב עבור ניתוחים קוסמטיים, זריקות עורי, השתלת עצם, וניתוח שחזור. מקורות col1 לנהלים אלה הם בדרך כלל לא אנושיים, דבר המגדיל את הפוטנציאל לדלקת ודחייה, כמו גם העברת מחלות xenobiotic. לאור זאת, בשיטה יעילה ומהיר כדי לטהר col1 מכמויות מוגבלות של רקמות autologously נגזרות תעקוף רבות של בעיות אלה, עם זאת, פרוטוקולי בידוד סטנדרטיים הם ארוכים ולעתים קרובות דורשים כמויות גדולות של collagenous רקמות. הנה, אנחנו מדגימים שיטת חילוץ col1 יעילה המפחיתה את הזמן הדרוש לבודד ולטהר חלבון זה בערך מ 10 ימים פחות מ 3 שעות. אנחנו בחרנו בדרמיס כמקור לרקמות שלנו בגלל זמינותו בהרבה ניתוחים. Tהשיטה שלו משתמשת במאגרי חילוץ מסורתיים בשילוב עם תסיסה חזקה וסינון צנטריפוגלי להשיג מאוד טהור col1, מסיס מכמויות קטנות של גלד. בקצרה, ביופסיות עורי נשטפות ביסודיות ב DH קר כקרח 2 O לאחר הסרת שומן, רקמת חיבור, ושיער. דגימות העור הופשטו מחלבונים והסוכרים noncollagenous באמצעות נתרן אצטט M 0.5 וhomogenizer ספסל העליון במהירות גבוהה. קולגן ממוצקי שיורי מופק לאחר מכן עם חיץ ציטרט הנתרן 0.075 M באמצעות homogenizer. תמציות אלה הם מטוהרים באמצעות 100,000 מסננים MW חתוכים הצנטריפוגלי שיניבו הכנות col1 באיכות דומה או עדיפה על מוצרים מסחריים או לאלה שהושגו באמצעות נהלים מסורתיים. אנו צופים בשיטה זו תאפשר הניצול של col1 autologously נגזר עבור מספר רב של מחקר ויישומים קליניים.
Introduction
במשך עשרות שנים, חוקרים וספקים מסחריים יש לבודד col1 solubilized ממגוון של מקורות, כולל רקמת עור וגידים באמצעות גרסה כלשהי של פרוטוקול פשוט הפקת חומצה ואחרי נטרול, שתוצאתה resuspension של מטריצה של סיבי col1 מאורגנים שניתן להשתמש בי עבור מספר רב של יישומים ביו 1-4. אמנם יש דוגמאות רבות של יישומים קליניים לcol1, כמה מהם להעסיק col1 autologously נגזר בגלל הכנה של חלבון זה דורשת עקירות ארוכות לוקחת ימים או שבועות כדי לבצע 5-7. כתוצאה מכך, חוקרי מחקר ורופאים בדרך כלל להשתמש בתכשירים יקרים, מסחריים של col1 שהוכנו באמצעות רקמות אנושיות כגון חולדה, שור, או גלד חזירי או באמצעות עור הוסר מן הגופות או בעקבות מילת גברים. עבור יישומי משובי, רבים של השתנות אלה תערוכת מוצרים ביחס ליכולת שלהם לצורה מוצקהמטריצות או מבני רקמות מסוגלים לתמוך מצורף תא וצמיחה. כתוצאה מכך, יש צורך מובהק לשיטה סטנדרטית חדשה שנועדה לחלץ במהירות col1 ממקורות רקמות עצמיים נגישים ושפע.
שיטה כזו תחסוך זמן וכסף במסגרת המחקר שבו col1 אפשר להפיק ממודל החיה של עניין ומשמש לבדיקה קליני של רקמות מהונדסות התאספו על פיגומים מבוססי קולגן. במקביל, יש את האפשרות של שימוש במהירות col1 מבודד, autologously נגזר במרפאת יגדיל את הבטיחות הכוללת של חולים שאמורים היה לקבל אלוגנאית או תכשירי xenogeneic. לחולים שקבלו הכנת autogeneic, שיטה יעילה זה תהיה לצמצם במידה ניכרת את המרווח בין אוסף ביופסיה ויישום קולגן. מסיבות אלה, בקשנו לשפר את שיטת בידוד וטיהור col1 הוקמה ארוך באמצעות AG במהירות גבוההitation וצנטריפוגה בגודל הדרה. שיטה זו היא פשוטה לביצוע באמצעות מאגרים סטנדרטיים וציוד שנמצאו במעבדות רבות. על ידי העסקת תסיסה במהירות גבוהה, הפרוטוקול שלנו מקטין את הזמן הדרוש כדי לבודד מסיס col1, עורי מכ 10 ימים פחות מ 3 שעות 8. חשוב מכך, בשיטה זו ניתן לבצע בקלות בסביבה הקלינית על מנת להכין col1 autologously נגזר לשימוש בחולים בקבוצה אחת של נהלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מרכיב חיוני בשיטה זו הוא יעילה הדחיסה החוזרת של דגימת עורי להסיר את הנוזל עודף. זה קריטי כדי להסיר כמה שיותר נתרן אצטט ככל האפשר בשלב 2.5 ידי דחיסת המדגם. אנו משתמשים במרית כדי לדחוס את העור מפני הצד של הצינור, אך יכולה לשמש גם גזה, אם כי זה יחייב ההסרה של המדגם מהצינור ול…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר ממכון הבריאות הלאומי (HL068915 לDBC), פרס חוקר חדש מקרן מחקר Thrasher (לCAP), גרנט-in-Aid מאיגוד הלב האמריקאי (12GRNT11910008 לDBC) , מענק מחקר מהקרן לילדים לב (לDBC), ותרומות לבית החולים לב ההולכה הקרן לילדים בבוסטון, קרן ריאן המשפחתית, ועל ידי דוד פולמן.
Materials
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | – |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g. |
Referências
- Nageotte, J. Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué. CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).
- Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. Electron microscope investigation of the structure of collagen. J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).
- Choi, Y. H., et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).
- Pacak, C. A., Cowan, D. B. Fabrication of myogenic engineered tissue constructs. J. Vis. Exp. (27), (2009).
- Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin. Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Seifter, S., Gallop, P., Colowick, S., Kaplan, N. Preparation and properties of soluble collagens. Methods in Enzymology. , (1963).
- Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).
- Ohan, M. P., Dunn, M. G. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).
- Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).
- Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study. Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).
- Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. 3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment. Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).
- Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).
- Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256. Science. 155, 1259-1261 (1967).
