En förbättrad metod för framställning av typ I kollagen från huden

Summary

Traditionella förfaranden för isolering av lösligt typ 1 kollagen (COL1) kräver ca 10 dagar från början till slut på grund av långa buffert inkubationer och mödosamma resuspensions av fibriller. Här beskriver vi ett sätt att rena COL1 från små dermala biopsier på mindre än tre timmar.

Abstract

Lösliga typ 1 kollagen (COL1) används i stor utsträckning som ett klister substrat för cellkulturer och som en cellulär klätterställning för regenerativa applikationer. Kliniskt är detta protein i stor utsträckning för kosmetisk kirurgi, dermal injektioner, ben ympning, och rekonstruktiv kirurgi. Källorna till COL1 för dessa förfaranden är vanligen icke-mänskliga, vilket ökar risken för inflammation och avvisande samt överföring xenobiotisk sjukdom. Mot bakgrund av detta, skulle en metod för att snabbt och effektivt rena COL1 från begränsade mängder autologously-härledda vävnader kringgå många av dessa frågor, men standardisoleringsprotokoll är långa och kräver ofta stora mängder av kollagena vävnader. Här visar vi en effektiv COL1 extraktionsmetod som minskar den tid som behövs för att isolera och rena detta protein från cirka 10 dagar till mindre än 3 tim. Vi valde dermis som vår vävnadskälla på grund av sin tillgänglighet under många kirurgiska ingrepp. Thans metod använder traditionella utsugs buffertar i kombination med kraftfulla agitation och centrifugal-filtrering för att erhålla högt rent, lösligt COL1 från små mängder av läderhuden. I korthet är dermal biopsier tvättas noggrant i iskallt dH ₂ O efter att ta bort fett, bindväv, och hår. Hudproven strippas av noncollagenous proteiner och polysackarider med användning av 0,5 M natriumacetat och en hög hastighet bänkhomogenisator. Kollagen från kvarvarande fasta substanser extraheras därefter med en 0,075 M natriumcitrat-buffert med användning av homogenisator. Dessa extrakt renas med hjälp av 100.000 MW cut-off centrifugal filter som ger Kol1 beredningar av jämförbar eller bättre kvalitet till kommersiella produkter eller de som erhållits med hjälp av traditionella förfaranden. Vi räknar med den här metoden kommer att underlätta utnyttjandet av autologously härledd COL1 för en mängd forskning och kliniska tillämpningar.

Introduction

I decennier har forskare och kommersiella leverantörer isolerade upplöst COL1 från ett sortiment av vävnadskällor inklusive hud och senor med hjälp av någon variant av en enkel syraextraktion protokoll följt av neutralisering, vilket resulterar i en resuspension av en matris av organiserad Kol1 fibriller som kan användas för en mängd olika biomedicinska tillämpningar ^1-4. Det finns många exempel på kliniska tillämpningar för COL1, några av dessa sysselsätter autologously-härledda COL1 eftersom beredningen av detta protein kräver långa extraktioner ta dagar eller veckor att utföra ^5-7. Som ett resultat av forskning utredare och läkare använder i allmänhet dyra, kommersiella beredningar av COL1 som är beredda att använda ickemänskliga vävnader såsom råtta, nötkreatur eller svin corium eller med hjälp av hud bort från kadaver eller efter manlig omskärelse. För regenerativa applikationer, att många av dessa produkter uppvisar variabilitet med avseende på deras förmåga bildar fastmatriser eller vävnads konstruktioner som kan stödja cellbindning och tillväxt. Följaktligen finns det ett tydligt behov av en ny standardiserad metod utformad för att snabbt extrahera COL1 från tillgängliga och rikliga autologa vävnadskällor.

En sådan metod skulle spara både tid och pengar i forskning miljö där COL1 kunde extraheras från djurmodell av intresse och används för preklinisk testning av tekniska vävnader monterade på kollagenbaserade ställningar. Samtidigt, skulle ha möjlighet att använda ett snabbt-isolerad, autologously härledda COL1 på kliniken öka den totala säkerheten för patienter som annars skulle få allogena eller xenogena preparat. För patienter som får ett autogent preparat, skulle denna strömlinjeformade metoden kraftigt minska intervallet mellan biopsi insamling och kollagen ansökan. Därför sökte vi för att förbättra på en sedan länge etablerad COL1 isolering och reningsmetod med hjälp av höghastighets agitation och storlek-utanförskap centrifugering. Denna metod är enkel att utföra med användning av standardbuffertar och-utrustning som har hittats i många laboratorier. Genom att använda höghastighets agitation, minskar våra protokoll den tid som krävs för att isolera löslig, dermal COL1 från cirka 10 dagar till mindre än 3 tim ^8. Viktigt kan denna metod lätt utföras i klinisk miljö för att förbereda autologously-härledda COL1 till patienter under en enda uppsättning förfaranden.

Protocol

Här kommer vi att visa att isoleringen av COL1 från lammskinn. Som skrivet, kan detta protokoll också användas för att framgångsrikt isolera COL1 från kanin och mänsklig hud. 1. Förbered Dermal Prov Jämvikta alla reagenser till 4 ° C före användning. Skölj huden prov (25-50 g) i iskall dH 2 O och ta bort all ull, päls eller hår med hårborttagningskräm. Använd en enda kant rakblad för att skrapa provet fri från bindväv och fett. …

Representative Results

Denna COL1 isolering protokollet kräver cirka 2 timmar och 15 minuter att slutföra. Figur 1 visar ett schematiskt diagram som sammanfattar de viktigaste stegen i detta förfarande. Preparering av provet och utföra de 7 cykler av höghastighets agitations och sköljer med natriumacetat tar ungefär 35 min (figurerna 1A-C). Utföra en agitation och skölj cykel med dH 2 O tar ca 5 minuter (figur 1D och 1E). Lägga natriumcitrat och utsätta provet för en om…

Discussion

En avgörande komponent för att denna metod är den upprepade effektiv komprimering av den dermala provet för att avlägsna överskott av vätska. Det är viktigt att avlägsna så mycket natriumacetat som möjligt i steg 2,5 genom att komprimera provet. Vi använder en spatel för att kompaktera hud mot sidan av röret, men kunde ostduk också användas, även om detta skulle kräva avlägsnande av provet från röret och öka den tid som krävs för att utföra dessa steg. Likaså är det viktigt att komprimera prov…

Materials

FastPrep-24 System	MP Biomedicals	116004500	–
Centrifuge	Beckman	J6-MI	Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.