세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em> 리스테리아</em
Summary
리스테리아 균은 자주 세포 내 기생의 연구를위한 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세균 병원체이다. 후반 L. 이미징 소 간섭 RNA 화면의 문맥 내 감염 단계 모노 사이토 겐은 표적 숙주 세포의 세균 감염에 필요한 세포 경로의 글로벌 학습을 허용한다.
Abstract
세균의 세포 내 병원균 절묘하게 조작 및 호스트 대상 조직의 감염에 필요한 세포의 기능을 파괴하는 그들의 능력에 의한 세포 신호 폭포를 해부하는 분자 도구로 생각 될 수있다. 이러한 세균성 병원균 가운데, 리스테리아 균은 세포 면역 반응의 특성에 세포 내 기생에 대한 패러다임으로 사용 된 그람 양성 미생물이며, 세포 골격과 막 인신 매매의 역 동성을 제어하는 분자 경로의 발견에서 쓸모있는 역할을했다한다. 이 문서에서는, 우리는 L. 늦은 세포 감염 단계의 검출을위한 강력한 현미경 분석을 설명 모노 사이토는 InlC, 감염된 세포의 세포질에 축적 박테리아 분비 단백질의 형광 표지에 근거,이 분석은 숯불하기 위해 자동화 고 처리량 소 간섭 RNA 스크린에 연결될 수있다감염의 상향 또는 하향 조절에 관여 세포 신호 전달 경로를 acterize.
Introduction
그람 양성 세균 리스테리아 균은 숙주 세포에 침입의 국제화 공포를 방해하고 숙주 세포 1의 세포질에서 복제 식품 매개 병원체이다. L. 세포 및 동물 모델에서 관찰 된 세균의 독성 특성의 지속성과 관련된 실험실 컨텍스트 (급속한 성장, 건강한 개인에 대한 낮은 독성)의 조작의 용이성 모노 사이토 겐 (용혈성 활동, 백혈구가)의 주요 모델로 1960 년에 처음 사용 허용 세포 내 기생의 감염 2에 대한 세포 성 면역의 이론적 기초의 설립을위한 연구. 1980 년대 후반과 1990 년대 초반, 세균의 세포주기 3뿐만 아니라 가장 중요한 세균의 독성의 분자 특성의 해부는 4-7 L.의 사용을 선호하는 요인 조작 및 스터드의 핵심 분자 도구로 모노 사이토 제네스숙주 세포 기능의 Y. 리스테리아 속에서 무독성의 존재 (L.의 innocua)과 악성 (L. monocytogenes에) 종 비교 게놈 연구 8 도로를 포장하는, 함께 완전한 L.의 최근 설립과 함께 모노 사이토는 L.의 진화에 대한 우리의 이해를 증가, 9 사체 인간 병원체 등의 감염을위한 모델 시스템으로 모노 사이토는 10 연구.
L. monocytogenes에 자신의 숙주 세포 수용체 각각 E-cadherin의와 메트로, 11 ~ 12과 박테리아 표면 단백질 InlA 및 InlB의 상호 작용에 따라 숙주 세포로의 내면화를 유도한다. 초기 후보 기반 연구의 InlB – 중요한 음향과 InlA 침략의 통로 (13)와 phosphoinositide 3 – 키나제 (PI 3-K)의 중요한 구성 요소로서 α / β의 catenins – 굴지 링크의 식별에지도 의존 침공 casca데 14 ~ 15. 프로테오믹스 및 기능 기반의 분석 이후에 허용 된 새로운 골격 요소 (16)와 숙주 세포의 침공에 필요한 지질 두 번째 메신저 (17)의 식별. 전사 연구 (18)와 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스 (19)는 최근 호스트 신호 폭포의 활성화와 L. 동안 면역 반응의 억제에 관한 새로운 빛을 발산했다 감염 모노 사이토 겐. 시스템 생물학은 작은 간섭 RNA에 의한 유전자 (kinomes, 전체 게놈)의 큰 세트의 불 활성화에 기반 접근 (siRNA의) 침묵은 최근 식균 작용을 포함한 특정 세포 기능의 컨텍스트에서 폭포 신호 글로벌 호스트의 분석을위한 새로운 길을 열고있다 병원체 내면화 20. 게놈 전체의 siRNA 화면은 이전에 L.의 감염에 필요한 세포의 계곡을 조사하기 위해 수행 된 식세포 초파리 모노 사이토 제네스 </em> S2 세포를 21 ~ 22 만, 이러한 유형의 분석은 비 식세포로 수행되지 않은, 생체 내에서 감염을위한 중요한 표적을 나타낸다.
우리는 L.에 의해 감염의 후반 단계의 현미경 검출을위한 프로토콜을 최적화 한 상피 세포 내 세균 항목의 높은 처리량의 siRNA 연구에 적합 모노 사이토 제네스. 우리의 분석은 매우 침습적 L. 활용 PRFA, L.의 주요 전사 조절에 점 돌연변이를 제시 변형 모노 사이토 겐 독성이 6 요인 리스테리아 모노 사이토 겐 (PRFA * 이름)이 돌연변이는 23 PRFA는 구조적으로 활성 렌더링 때문에, 그렇지 않으면 제대로 감염된 비 식세포의 세균 항목을 호의를 침공 단백질 InlA 및 InlB의 발현 증가로 연결됩니다. 감염에 대한 우리의 판독은 분비 된 세균의 단백질 InlC의 세포질 축적의 검출을 기반으로이 분자는내 세포질 L.에 의해 우선적으로 발현되는 형질 발현 이펙터 모노 사이토 9 참여는 박테리아 세포에 세포 24를 전파뿐만 아니라, 호스트 면역 반응 25을 변조하는뿐만 아니라. 세포 내 세균에 의해 InlC 분비의 형광 표시가 명확하게 감염되지 않은 세포에서 감염과 구별 할 수 있지만, 또한 엔드 포인트 이후의 여러 단계에서 감염을 해부하는 데 사용할 수있는 판독 나타냅니다뿐만 아니라 : 항목, 액포 탈출, 세포 내 세균을 증식과 세포 간 확산. 이 현미경 기반 프로토콜 따라서 L. 의한 숙주 세포의 감염에 관련된 세포 경로를 연구하는 siRNA를 스크린에 연결될 수있다 모노 사이토 제네스.
Protocol
Representative Results
Discussion
몇개의 파라미터는 InlC 신호의 명확한 검출을 허용하기 위해 충분히 큰 세포질 표시 건강한 세포주의 사용을 포함하는 트립 InlC 검출 프로토콜의 성공에 중요하다. 분석에서 우리는 우리가 인해 세포질 공간의 확장에 대한 우리의 분석에 특히 적합하다 헬라 CCL2 세포의 사용을 제안하고이 문서에서 제시 등의 헬라 교토 세포와 같은 다른 헬라 클론 작은 세포질을 표시하지만, 사용할 수 있습니다 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P. Cossart 실험실에서 연구는 파스퇴르 연구소, 문화원 국립 드 라 상테 외 드 라 공들인 Médicale, 문화원 내셔널 드 라 공들인 Agronomique, ERC 고급 그랜트 (233348), 직원은 국립 드 라 공들인 (부여 MIE-에서 지원 SignRupVac), 루이 Jeantet 재단과 매그 르 로크 레 무 스케 타이. AK는 파스퇴르 파리 대학 국제 박사 과정 / 문화원 카르노 만성 질환 Infectieuses에서 장학금을받는 사람입니다. 우리는 세포의 형질 전환 프로토콜을 최적화 제이슨 머서 감사합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
Referências
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