Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em> Listeria monocytogenes</em
Summary
Listeria monocytogenes ist ein Gram-positiven bakteriellen Erreger häufig als ein Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus verwendet. Imaging späten L. monocytogenes-Infektion Stufen im Rahmen der kleinen interferierenden RNA Bildschirme ermöglicht die globale Untersuchung von zellulären Wege für die bakterielle Infektion von Zielwirtszellen erforderlich.
Abstract
Bakterienintrazelluläre Pathogene können als molekulare Werkzeuge zur zellulären Signalkaskaden auf Grund ihrer Fähigkeit, vorzüglich zu manipulieren und zu untergraben Zellfunktionen, die für die Infektion von Wirtszielgewebe erforderlich sezieren konzipiert werden. Unter diesen bakteriellen Erreger ist Listeria monocytogenes eine Gram-positiven Mikroorganismus, der als Paradigma für den intrazellulären Parasitismus in der Charakterisierung der zellulären Immunantworten verwendet wurde, und die instrumentelle Rolle in der Entdeckung der molekularen Signalwege steuern Zytoskelett-und Membrantransport Dynamik gespielt hat. In diesem Artikel beschreiben wir einen robusten mikroskopischen Assay zum Nachweis von zellulären Infektion späten Stadien von L. monocytogenes auf der Basis der Fluoreszenzmarkierung InlC, eine sekretierte bakterielle Protein, das im Cytoplasma von infizierten Zellen akkumuliert, dieser Assay für automatisierte Hochdurchsatz-small interfering RNA-Bildschirme, um char gekoppelt werdenacterize zelluläre Signalwege in der Auf-oder Abwärtsregulierung der Infektion beteiligt.
Introduction
Die Gram-positiven Bakterium Listeria monocytogenes ist ein Lebensmittel übertragbaren Krankheitserreger, der Wirtszellen eindringt, stört seine Internalisierung Vakuole und repliziert im Zytoplasma der Wirtszellen ein. L. monocytogenes Leichtigkeit der Manipulation im Labor Kontext (schnelles Wachstum, geringe Toxizität für gesunde Personen) mit dem Fortbestehen der in Zell-und Tiermodellen beobachtet bakteriellen Virulenz assoziiert (hämolytische Aktivität, Leukozytose) erlaubt seinen ersten Einsatz in den 1960er Jahren als Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus und für die Errichtung der theoretischen Grundlagen der zellulären Immunität gegen eine Infektion 2. In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren, die Präparation der bakteriellen intrazellulären Zyklus 3 sowie die molekulare Charakterisierung der wichtigsten bakteriellen Virulenzfaktoren 4-7 begünstigt die Verwendung von L. monocytogenes als Schlüssel molekulares Werkzeug für die Manipulation und Gestüty von Wirtszellfunktionen. Die Anwesenheit von avirulenten (L. innocua) und virulent (L. monocytogenes) Arten in der Gattung Listeria ebnete den Weg für die vergleichende Genomstudien 8, die zusammen mit der jüngsten Gründung der komplette L. monocytogenes Transkriptom 9, haben unser Verständnis der Evolution von L. erhöht monocytogenes als menschliche Krankheitserreger und als Modellsystem für die Infektion untersucht 10.
L. monocytogenes induziert seine Internalisierung in Wirtszellen bei Wechselwirkung der bakteriellen Oberflächenproteinen InlA und InlB mit ihren Wirtszellrezeptoren E-Cadherin und Met, jeweils 11-12. Anfängliche Kandidat-basierten Untersuchungen führten zur Identifizierung der α / β-Actin Cateninen Verbindung als wesentliche Komponente der InlA-Invasion Kanal 13 und der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3-K) als kritischer Effektor des InlB- abhängig Invasion cascade 14-15. Proteom-und Funktionsbasierte Assays anschließend erlaubt die Identifizierung neuer Zytoskelett-Elemente 16 und Lipid-Second Messenger 17 für Wirtszellinvasion erforderlich. Transkriptions-Studien 18 und Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik 19 haben vor kurzem ein neues Licht über die Aktivierung von Signalkaskaden und Gastgeber der Unterdrückung von Immunreaktionen während L. monocytogenes-Infektion. Auf der Grundlage der Inaktivierung von großen Gruppen von Genen (kinomes, komplette Genome) von small interfering RNA Systembiologie (siRNA) Silencing haben vor kurzem neue Wege für die Analyse der globalen Wirt-Signalkaskaden im Kontext der spezifischen zellulären Funktionen, einschließlich Phagozytose geöffnet und Erreger Internalisierung 20. Genomweite siRNA-Bildschirme haben bereits durchgeführt worden, um zelluläre Kaskaden zur Infektion von L. erforderlich untersuchen monocytogenes in phagocytic Drosophila </em> S2-Zellen 21-22, doch diese Art der Analyse nicht in nicht-phagozytische Zellen durchgeführt wurde, die kritische Ziele für die Infektion in vivo darstellen.
Wir haben ein Protokoll für die mikroskopische Detektion der späten Stadien der Infektion durch L. optimiert monocytogenes, die für die Hochdurchsatz-siRNA-Studien von Bakterieneintrag in Epithelzellen geeignet ist. Unser Assay nutzt ein hochinvasiven L. monocytogenes-Stamm, der eine Punktmutation in PrfA, der Haupttranskriptionsregulator von L. präsentiert monocytogenes Virulenzfaktoren 6: diese Mutation (benannt PrfA *) macht PrfA konstitutiv aktiven 23 und führt zu einer erhöhten Expression der Proteine Invasion InlA und InlB daher begünstigt bakterielle Eintrag in sonst schlecht nicht-infizierten Fresszellen. Unsere Auslese zur Infektion beruht auf dem Nachweis der Akkumulation des cytosolischen sezernierte bakterielle Protein InlC zugrunde: dieses Molekül isteine pleiotrope Effektor, der vorzugsweise durch intrazytoplasmatische L. exprimiert wird monocytogenes 9 und welche nimmt nicht nur in der bakteriellen Zelle-zu-Zelle verteilt 24 aber auch Wirtsimmunantwort moduliert 25. Die Fluoreszenzmarkierung InlC Sekretion von intrazellulären Bakterien ermöglicht nicht nur eine klare Unterscheidung infizierter von nicht-infizierten Zellen, sondern stellt auch eine Endpunktanzeige, die verwendet werden kann, um anschließend zu sezieren Infektion in verschiedenen Schritten: Eingabe vakuolären Flucht cytosolischen Bakterien Proliferation und Zell-zu-Zell-Ausbreitung. Dieses Mikroskopie-basiertes Protokoll kann siRNA Bildschirme gekoppelt werden daher zelluläre Signalwege bei der Infektion von Wirtszellen von L. beteiligt studieren monocytogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere Parameter sind kritisch für den Erfolg unserer InlC Erfassungsprotokoll, einschließlich der Verwendung von gesunden Zellinien Anzeigen einer ausreichend großen Zytoplasma eine eindeutige Erkennung der InlC Signals zu ermöglichen. Bei dem Test in diesem Artikel schlagen wir die Verwendung von HeLa CCL2-Zellen, die sich besonders gut für unseren Test geeignet aufgrund der Erweiterung ihrer zytosolischen Raum sind wir präsentieren, andere HeLa-Klone wie HeLa-Zellen Kyoto um einen kleineren Zytoplasma kann abe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in P. Cossart Labor ist vom Pasteur-Institut, dem Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, dem Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), der Agence Nationale de la Recherche (MIE-Zuschuss unterstützt SignRupVac), den Louis-Jeantet-Stiftung und der Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK ist ein Empfänger eines Stipendiums von den Pasteur-Universität Paris Internationale Promotionsprogramm / Institut Carnot Mala infectieuses. Wir danken Jason Mercer für die Optimierung der Zell Transfektionsprotokolls.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
Referências
- Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
- Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
- Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
- Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
- Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
- Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
- Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
- Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
- Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
- Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
- Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
- Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
- Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
- Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
- Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
- Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
- Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
- Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
- Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
- Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
- Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
- Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
