細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌<em>リステリア菌</em
Summary
リステリア菌は、頻繁に、細胞内寄生の研究のための主要なモデルとして用い、グラム陽性細菌の病原体である。後半L.イメージング低分子干渉RNA画面のコンテキスト内感染段モノサイトゲネスは、標的宿主細胞の細菌感染に必要な細胞経路をグローバル研究を可能にする。
Abstract
細菌の細胞内病原体は絶妙に操作し、宿主の標的組織への感染に必要な細胞機能を破壊するそれらの能力に起因する細胞のシグナル伝達カスケードを分析するための分子ツールとして考えることができる。これらの細菌の病原体の中では、 リステリア菌は、細胞性免疫応答の特徴づけに細胞内寄生のためのパラダイムとして使用されており、その細胞骨格と膜人身売買のダイナミクスを制御する分子経路の発見に尽力役割を果たしてきましたグラム陽性微生物である。この記事では、我々はLの遅い携帯感染の段階を検出するための堅牢な顕微鏡アッセイを記述リステリア InlC、感染細胞の細胞質に蓄積し、分泌された細菌タンパク質の蛍光標識をもとにして、このアッセイは、char型にするために、自動化ハイスループット低分子干渉RNAの画面に結合することができる感染のアップまたはダウンレギュレーションに関与する細胞シグナル伝達経路をacterize。
Introduction
グラム陽性菌、リステリア·モノサイトゲネス 、宿主細胞に侵入するその内部移行液胞を破壊し、宿主細胞1の細胞質で複製する食品媒介病原体である。L.細胞および動物モデルで観察細菌の病原性形質の持続性に関連した研究室のコンテキスト（急速な成長、健康な人のための低毒性）での操作のしやすさをモノサイトゲネス （溶血作用、白血球増加は）のための主要なモデルとして、1960年の最初の使用は許可されて細胞内寄生の感染2に対する細胞性免疫の理論的基礎の確立のための研究。 1980年代後半から1990年代には、細菌の細胞内サイクル3だけでなく、最も重要な細菌の病原性の分子特性の解剖は4-7 Lの使用を好む要因操作とスタッドのための重要な分子ツールとしてのリステリア宿主細胞の機能のY。 リステリア属の非病原性の存在（ のL.イノキュア ）と病原性（ リステリア菌 ）種は、比較ゲノム研究の8のための道を開いたこと、一緒に完全なLの最近の設立にリステリアは、L.の進化の理解を増加している、9をトランスクリプトームヒトの病原体として、感染の研究の10のためのモデル系として、 リステリア 。
リステリア菌は、それらの宿主細胞受容体はそれぞれ、E-カドヘリンおよびMet、11月12日で、細菌の表面タンパク質INLAおよびinlBの相互作用によって宿主細胞にその内在化を誘導する。最初の候補ベースの研究はINLBクリティカルなエフェクターとしてINLA -侵入経路13のとホスホイノシチド3 -キナーゼ（PI 3-K）の重要な構成要素として、α/βカテニン-アクチンリンクが同定された依存侵入カスカ14〜15·デ·。プロテオミクスおよび機能に基づくアッセイは、その後、新規な細胞骨格要素16および宿主細胞の浸潤に必要な脂質セカンドメッセンジャー17の同定を可能にした。転写の研究18と質量分析に基づく定量的プロテオミクス19は最近、ホストシグナル伝達カスケードの活性化とLの間の免疫応答の抑制に関する新たな光を当てるしている感染をモノサイトゲネス 。低分子干渉RNA（siRNA）をサイレンシングによる遺伝子（kinomes、完全なゲノム）の大きなセットの不活性化に基づいて、システム生物学的アプローチは、最近、食作用を含む特定の細胞機能のコンテキストでグローバルなホストシグナル伝達カスケード、解析のための新たな道を開いていて、病原体の内在化20。ゲノム規模のsiRNAスクリーンは、以前L.の感染に必要な細胞のカスケードを調査するために行われている食細胞ショウジョウバエのリステリア </eM> S2細胞21〜22が、この種の分析は、非食細胞中で行われていない、 生体内での感染のための重要な目標を表すものです。
我々はLで、感染の後期の顕微鏡検出のためのプロトコルを最適化しています上皮細胞内の細菌侵入のハイスループットのsiRNAの研究に適していネス 。我々のアッセイは、侵襲性の高いLのを利用していますprfAを点変異を提示するリステリア株、L.の主要な転写調節因子病原性は6因子 モノサイトゲネス ：（prfAを*という名前）は、この変異は23 prfAをが構成的に活性なレンダリング、したがって、そうでなければ不十分な感染非食細胞における細菌侵入を好む、侵入タンパク質INLAおよびinlBの発現増加につながる。感染のための私達の読み出しは、分泌された細菌タンパク質InlCの細胞質ゾル蓄積の検出に基づいている。この分子である細胞質内Lで優先的に発現される多面的エフェクターリステリア 9と参加し、細菌細胞間に24を広めるだけでなく、宿主の免疫応答25を変調するだけではなく。細胞内細菌によるInlC分泌の蛍光標識は、明らかに非感染細胞からの感染を区別することを可能にするだけでなく、その後の別工程で感染を分析するために使用することができ、エンドポイントの読み出しを表していない場合のみ：エントリー、液胞の脱出、細胞質性細菌を増殖および細胞から細胞への広がり。この顕微鏡ベースのプロトコルは、したがって、L.による宿主細胞の感染に関与する細胞経路を研究するためのsiRNAスクリーニングに結合することができるリステリア 。
Protocol
Representative Results
Discussion
いくつかのパラメータがInlC信号の明確な検出を可能にする十分に大きな細胞質を表示する健康な細胞株の使用を含む、我々のInlC検出プロトコルの成功のために重要である。検定では、我々は、それらの細胞質ゾルのスペースの拡張に私たちの分析に特に適しているのHeLa CCL2細胞の使用を提案し、この記事で提示し、このようなヒーラ京都細胞のような他のHeLa細胞クローンは小さく、細胞質?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P. Cossart研究室での研究は、パスツール研究所、研究所国立·デ·ラ·サンテら·デ·ラ·ルシェルシュMédicale、研究所国立·デ·ラ·ルシェルシュAgronomique、ERCアドバンスト·グラント（233348）、通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（グラント三重でサポートされているSignRupVac）、ルイ·Jeantet財団と財団ル·ロッシュレMousquetaires。 AKは、パスツール、パリ大学国際博士課程/研究所カルノー病気Infectieusesから奨学金の受取人である。我々は、細胞のトランスフェクションプロトコルを最適化するためのジェイソンマーサーに感謝します。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
Referências
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