Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em> Listeria monocytogenes</em

Summary

A Listeria monocytogenes é uma bactéria patogénica gram positiva frequentemente utilizado como um importante modelo para o estudo de parasitismo intracelular. Imagiologia tarde L. monocytogenes fases de infecção dentro do contexto de telas de ARN pequenos interferentes permite o estudo global de vias celulares necessários para a infecção bacteriana de células hospedeiras alvo.

Abstract

Patógenos intracelulares bacterianas podem ser concebidas como ferramentas moleculares para dissecar as cascatas de sinalização celular, devido à sua capacidade de manipular requintadamente e subverter as funções das células que são necessários para a infecção dos tecidos-alvo do hospedeiro. Entre estes agentes patogénicos bacterianos, Listeria monocytogenes é um microrganismo gram-positivo que tem sido usada como um paradigma para parasitismo intracelular na caracterização das respostas imunes celulares, e que tem desempenhado as funções instrumentais na descoberta de vias moleculares que controlam citoesqueleto e membrana dinâmica de tráfico. Neste artigo, os autores descrevem um ensaio microscópico robusto para a detecção de níveis de infecção celular final de L. monocytogenes baseado na marcação fluorescente do inLC, uma proteína bacteriana segregada que se acumula no citoplasma de células infectadas, o ensaio pode ser acoplado a high-throughput telas pequenas automatizados ARN interferentes, de modo a characterize vias de sinalização celular envolvidas no cima ou para baixo-regulação da infecção.

Introduction

A bactéria Gram positiva Listeria monocytogenes é um agente patogénico de origem alimentar que invade células hospedeiras, interrompe a sua internalização vacúolo e replica-se no citoplasma das células hospedeiras ^1. L. monocytogenes facilidade de manipulação no âmbito de laboratório (crescimento rápido, uma baixa toxicidade para os indivíduos saudáveis) associada à persistência de traços de virulência da bactéria observadas em modelos celulares e animais (actividade hemolítica, leucocitose) permitiu o seu uso inicial em 1960 como um modelo para a maior o estudo do parasitismo intracelular e para o estabelecimento dos fundamentos teóricos da imunidade celular contra a infecção ^2. No final de 1980 e início de 1990, a dissecação do ciclo intracelular bacteriana ^3, bem como a caracterização molecular da virulência bacteriana mais importante fatores ^4-7 favoreceu o uso de L. monocytogenes como ferramenta molecular chave para a manipulação e cravoy de funções da célula hospedeira. A presença de avirulent (L. innocua) e (L. monocytogenes) espécies virulentas do gênero Listeria pavimentou o caminho para estudos genômicos comparativos ⁸ que, juntamente com a recente criação da L. completo monocytogenes transcriptoma ^9, aumentamos nossa compreensão da evolução de L. Listeria como um patogénico humano e como um sistema modelo para estudos de infecção ^{de 10.}

L. monocytogenes induz sua internalização em células hospedeiras após a interação das proteínas da superfície bacteriana inla e inlB com seus receptores da célula hospedeira E-caderina e MET, respectivamente ^11-12. Estudos de base candidata inicial levou à identificação de uma ligação cateninas-actina α / β como um componente significativo da via ^inla-13 e invasão da fosfoinositida 3-quinase (PI 3-K) como um efector crucial do inlB- dependente casca invasãode ^14-15. Ensaios de proteômica e baseados em funcional, posteriormente, permitiu a identificação de novos elementos do citoesqueleto ¹⁶ e lipídios segundos mensageiros ¹⁷ necessários para a invasão da célula hospedeira. Estudos de transcrição ¹⁸ e proteômica baseada em espectrometria de massa quantitativos ¹⁹ lançaram recentemente uma nova luz sobre a ativação da sinalização de acolhimento cascatas ea repressão da resposta imune durante L. monocytogenes infecção. Biologia de sistemas abordagens baseadas na inativação de grandes conjuntos de genes (kinomes, genomas completos) por pequeno RNA de interferência (siRNA) silenciamento abriram recentemente novos caminhos para a análise do acolhimento global de cascatas de sinalização no contexto de funções celulares específicas, incluindo a fagocitose e patógeno internalização ^20. Telas siRNA Genome-wide foram previamente realizados para investigar cascatas celulares necessários para a infecção de L. monocytogenes em fagocitária Drosophila </em> ^21-22 células S2, mas este tipo de análise não foi realizada em células não fagocíticas, que representam alvos importantes para a infecção in vivo.

Nós otimizamos um protocolo para a detecção microscópica dos estágios finais da infecção por L. monocytogenes, que é adequada para estudos de alta produtividade siRNA de entrada de bactérias no interior das células epiteliais. Nosso ensaio se aproveita de uma L. altamente invasivo monocytogenes cepa que apresenta uma mutação pontual na PrfA, o principal regulador da transcrição de L. monocytogenes virulência ^6: esta mutação (chamado PrfA *) torna PrfA constitutivamente activa ²³ e conduz a um aumento da expressão das proteínas de invasão inla inlB e, portanto, favorecer a entrada de bactérias em células não fagocíticas outro modo mal infectados. A nossa leitura de infecção baseia-se na detecção da acumulação citosólica do inLC proteína bacteriana segregada: esta molécula éum efector pleiotrópico que é expressa preferencialmente pelas intra-citoplasmático L. monocytogenes ⁹ e que não só participa na célula-a-célula bacteriana espalhar ^24, mas que também modula as respostas imunitárias do hospedeiro ^25. A marcação fluorescente de secreção inLC por bactérias intracelulares não só permite distinguir claramente infectada a partir de células não-infectadas, mas também representa uma leitura de ponto final que pode ser usada para dissecar posteriormente infecção em suas diferentes etapas: entrada, escape vacuolar, citosólica bacteriana proliferação e disseminação célula-a-célula. Este protocolo baseado em microscopia pode ser acoplado a telas de siRNA, por conseguinte, para estudar vias celulares envolvidas na infecção de células hospedeiras por L. monocytogenes.

Protocol

1. Preparação de culturas celulares e bacterianos, ferramentas de transfecção e Anticorpos Primários Prepare uma placa de ágar fresco para isolar L. indivíduo monocytogenes colónias a partir de um estoque de glicerol bacteriana (50% glycerol/50% saturada de cultura durante a noite de bactérias líquido) mantida a -80 ° C. Usando uma cremalheira de alumínio (mantidos à temperatura de -80 ° C) para o transporte de um estoque de glicerol congelado de bactérias, bactérias…

Representative Results

Marcação fluorescente de citoplasmática inLC fornece uma leitura robusta para a infecção de células por L. monocytogenes, como ilustrado na Figura 1: a célula central na micrografia é altamente infectados pela estirpe P14.PrfA * 23, uma vez que pode ser observada na imagem de contraste de fase (setas, Figura 1A) e confirma-se por o sinal de DAPI onde bactérias individuais podem ser claramente distinguidos (Figura 1B). A coloração inLC (sob…

Discussion

Vários parâmetros são fundamentais para o sucesso do nosso protocolo de detecção inLC, incluindo o uso de linhas de células saudáveis ​​que apresentam um número suficiente de citoplasma para permitir uma detecção inequívoca do sinal inLC. No ensaio que apresentamos neste artigo, propomos o uso de células HeLa CCL2, que são particularmente adequados para o nosso ensaio, devido à extensão de seu espaço citosólico; outros clones HeLa como as células HeLa Kyoto exibir um citoplasma menor, mas pode ser …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bacto Brain Heart Infusion	BD	237500	For liquid BHI preparation
Bacto Agar	BD	214010	Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	Biowest	51830-500
DMEM	Invitrogen	61965-026
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778-100
Gentamicin	Sigma	G1397-10ML
Formaldehyde (16%)	EMS	15710	Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546	Invitrogen	A-11035
DAPI	Invitrogen	D-1306
Phalloidin Dy647	Dyomics	647-33
siRNA Scramble	Dharmacon	D-001810-10
siRNA Met	Dharmacon	L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate	Corning	3985
AxioObserver Z1 microscope	Zeiss	431007 9901
sCMOS camera	Andor	Neo
Metamorph analysis software	Molecular Devices	4000
CellProfiler analysis software	Broad Institute	Public software available at http://www.cellprofiler.org/