Summary
Las ondas de choque en la actualidad son bien conocidos por sus efectos regeneradores. Por lo tanto, los experimentos in vitro son de creciente interés. Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo in vitro para los ensayos de la onda de choque en (IVSWT) que nos permite imitar las condiciones in vivo, evitando así los efectos físicos que distraen.
Abstract
Las ondas de choque en la actualidad son bien conocidos por sus efectos regeneradores. Resultados de las investigaciones básicas demostraron que las ondas de choque causan un estímulo biológico a las células o tejido diana sin ningún daño posterior. Por lo tanto, los experimentos in vitro son de creciente interés. Se han descrito varios métodos de aplicación de ondas de choque en cultivos celulares. En general, todos los modelos existentes se centran en cómo aplicar mejor las ondas de choque en las células.
Sin embargo, esta pregunta sigue siendo: ¿Qué sucede con las olas después de pasar el cultivo celular? La diferencia de la impedancia acústica del medio de cultivo celular y el aire ambiente es tan alto, que más del 99% de ondas de choque se reflejan! Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo que consiste principalmente en un recipiente de plexiglás incorporado que permite a las olas se propaguen en el agua después de pasar el cultivo celular. Esto evita efectos de cavitación, así como la reflexión de las ondas que de otra manera perturbar los próximos. With este modelo somos capaces de imitar las condiciones in vivo y por lo tanto ganar más y más conocimiento sobre cómo el estímulo físico de las ondas de choque se traduce en una señal de célula biológica ("mechanotransduction").
Introduction
Las ondas de choque son ondas de presión sonora que surgen de una súbita liberación de energía, por ejemplo. como un trueno cuando un rayo. En la medicina ondas de choque se han utilizado durante más de 30 años en litotricia para la desintegración de cálculos renales. Desde el hallazgo incidental de ilíaca engrosamiento óseo en pacientes Litotricia a principios de 1980, se llevaron a cabo los primeros estudios para evaluar el efecto del tratamiento con ondas de choque (SWT) en el hueso de curación 1. Resultados impresionantes de una mejor curación de seudoartrosis de huesos largos se pudieron observar 2. Posteriormente, las indicaciones se ampliaron a las heridas de tejidos blandos 3. Resultados de las investigaciones básicas mostraron que las ondas de choque causan un estímulo biológico al tejido diana sin ningún daño posterior. La liberación de factores de crecimiento angiogénicos (por ejemplo, VEGF, PlGF, FGF) es seguida por una angiogénesis significativa. Esto condujo a una mayor expansión de las indicaciones hacia las patologías isquémicas. Nuestro grupo y otros mostraron el eff positivoect de SWT en la cardiopatía isquémica en modelos animales como en ensayos clínicos 4-6.
Sin embargo, el mecanismo exacto de cómo se traduce el estímulo físico de SWT en una señal biológica (mecanotransducción) permanece en gran medida desconocido. A medida que el interés en la SWT de varios campos de la medicina aumenta continuamente, la búsqueda del mecanismo es cada vez más intensa. Por lo tanto, los experimentos in vitro de ondas de choque están ganando importancia. Además de la reducción de la experimentación con animales y la rentabilidad, la mayor ventaja de vitro tratamiento con ondas de choque en (IVSWT) puede ser la posibilidad de estudiar el comportamiento específico de un determinado tipo de célula. En onda de choque la regeneración de tejidos mediada más probable todas las células del tejido tratado están involucrados, se discuten incluso efectos sistémicos. Sin embargo, cada tipo de célula juega un papel específico y tiene su propia función intrínseca. IVSWT nos permite detectar esta función en particular unnd con lo que nos da una mejor comprensión de los procesos subyacentes complejas.
El conocimiento de hoy acerca de los efectos de las ondas de choque en cultivos de células incluye el aumento de la proliferación, la alteración de los receptores de la membrana celular, aumento y la aceleración de la diferenciación celular, la liberación de factores de crecimiento y quimioatrayentes, así como aumento de la migración celular 7-9.
Se han descrito efectos físicos que causan distracción en la mayoría de modelos in vitro varios métodos de aplicación de ondas de choque en cultivos celulares. Este hecho conduce al problema de que es muy difícil comparar los resultados, ya que las condiciones físicas de la estimulación de células son muy diferentes entre estos modelos. En general, todos los modelos existentes se centran en cómo aplicar mejor las ondas de choque en las células.
Sin embargo, esta pregunta sigue siendo: ¿Qué sucede con las olas después de pasar el cultivo celular? El problema principal es que la diferencia de la acústicaimpedancia del medio de cultivo celular y el aire ambiente es tan alto, que más del 99% de ondas de choque se reflejan la Figura 1.
Debido a la diferencia en la impedancia acústica de los dos medios de las ondas se reflejan no sólo pero un desplazamiento de fase de 180 ° se produce resulta en fuertes fuerzas de tracción a las células Figura 2.
La impedancia acústica se define como el producto de la densidad de un material y su velocidad del sonido Z = ρ x c. Para el agua de la impedancia acústica es ZWater = 1440000 Ns / m 3, para que el aire que está a sólo 420 Ns / m 3. La gran diferencia de estos dos valores da lugar a la reflexión y el cambio de fase de las ondas de choque. El cambio de fase se vuelve un impulso de presión positiva en una onda de tensión.
Incluso si esta fuerza de tracción no es perjudicial para las células, que interfiere con la idea de imitar los efectos de ondas de choque in vivo in vitro. In vivo estosfuerzas de tracción casi no se producen debido a las grandes estructuras del cuerpo.
Además, la parte de atrás corriendo olas incluso puede perturbar los entrantes. Esto puede causar interferencias. Se conocen dos tipos de interferencia. La interferencia constructiva significa que se agregan dos olas que resulta en el doble de amplitud Figura 3. La interferencia destructiva ocurre si las ondas se encuentran diametralmente opuestos. Se hace que la abolición de las ondas (Figura 3). Por lo tanto, IVSWT necesita un modelo que permite a las ondas de choque para propagar después de pasar el cultivo celular.
Baño de agua IVSWT
Consideraciones siguientes las preocupaciones antes mencionados nos llevan a diseñar un baño de agua para evitar los problemas descritos Figura 4. Básicamente, consiste en un recipiente de plexiglás construido con una membrana para conectar cada tipo de onda de choque aplicador. Para el acoplamiento entre esta membrana y la transmisión de ultrasonidos aplicador GEL tiene que ser utilizado. El baño de agua se llena con agua desgasificada para evitar la cavitación que se produciría si el gas se soluted dentro del agua. Un calentador en la parte inferior con un sensor de temperatura conectado a una unidad de control permite regular la temperatura para la imitación de las condiciones in vivo y para evitar cultivos de células se enfríe durante el procedimiento. Temperatura se puede mantener estable a 37 grados centígrados, como se hace en una incubadora. Un soporte para las muestras de células permite la inmersión de cualquier tipo de frasco de cultivo o tubo. De este modo, el recipiente de la muestra necesita ser completamente lleno con medio de cultivo, como burbujas de aire bloquearían ondas de choque! Un absorbedor en forma de cuña en la pared del fondo de la bañera destructs olas con el fin de no quedar reflejada y volver corriendo para evitar interferencias.
Una ventaja adicional a otros modelos IVSWT es la posibilidad de variar la distancia entre el aplicador y los frascos de cultivo. Los hallazgos de nuestro grupo y otros que utilizan este modelo es claramentecómo que cada tipo de célula reacciona muy específicamente a diferentes parámetros de tratamiento. Por otra parte, la definición de la distancia entre la fuente de las ondas y la muestra es crucial, ya que nos permite controlar las células para estar en una posición específica en relación con el enfoque de la onda de choque aplicador.
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Protocol
Ethical permiso
Después de obtener el consentimiento informado por escrito de los pacientes, los cordones umbilicales se obtuvieron de cesárea en el Departamento de Ginecología para el aislamiento de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). El permiso fue dado por el comité de ética de la Universidad Médica de Innsbruck (no. UN4435).
1. Prepare la bañera de agua IVSWT
- Preparar 3,5 L de agua del grifo en un depósito adecuado. Necesita ser calentado a 37 ° C (véase el Protocolo 6) de agua.
- Llene el agua en el baño de agua hasta que el nivel del agua es de aproximadamente 3 cm por debajo del borde. Mente para cubrir completamente la membrana con agua. Esto requerirá aproximadamente el preparado 3.5 L.
- Conectar el sensor de temperatura a la fuente de alimentación.
- Ponga el sensor en la conexión prevista en la pared del fondo del baño de agua.
- Conectar el calentamiento a la fuente de alimentación del sensor de temperatura. No hacer esto sinagua en el baño como el calentador se derretiría el plexiglás.
- Espere hasta que el agua alcance una temperatura estable de 37 ° C. Revuelva el agua regularmente con algún tipo de palo para garantizar una temperatura constante durante todo el baño de agua.
2. Preparar Células y frascos de cultivo
- Se siembran las células durante la noche a la densidad deseada en frascos de cultivo T25 o cultivar las células en los matraces directamente hasta que han alcanzado la confluencia deseada.
- Antes del experimento, alinee los frascos verticalmente.
- Llene los frascos de cultivo con medio de cultivo hasta justo por debajo de sus cuellos. No llene demasiado medio en los frascos como medio de contacto en el cuello o la tapa de cierre se contaminaría.
- Tornillo de los frascos con tapas de sólidos sin filtros para evitar la contaminación del agua. Cuenta que el agua en el baño y el baño en sí no son estériles.
- Selle los tapones con Parafilm antes de la inserción en el baño de agua. <li> Fijar la cultura frascos sellados en el soporte suministrado.
- Inserte frasco fija en el baño de agua. Tenga cuidado de que el medio del matraz de cultivo de células es a la misma altura que el centro de la membrana de la onda de choque del aplicador. Una línea en el lado de la bañera le guía.
3. Definir los parámetros de tratamiento
- Define la distancia entre la fuente de ondas de choque y la muestra. Identificar los parámetros de tratamiento perfectos por la realización del experimento piloto parámetro hallazgo como se describe en la Figura 6.
- Elija los parámetros de tratamiento adecuado (densidad de flujo de energía, frecuencia) en el dispositivo de ondas de choque. Una vez más, consulte la Figura 6.
4. Aplicación de la onda de choque
- Ponga cantidades montón de gel de transmisión de ultrasonidos comercialmente disponible en la onda de choque de aplicación, así como en la membrana del baño de agua. Esto es para asegurar el acoplamiento. No hay aire o burbujas de aire deben estar entre el aplicador y la membrana comosería absorber las ondas de choque.
- Conectar aplicador a la membrana y mantenerla estable en el centro de la membrana. Tenga cuidado de que quede alineada horizontalmente.
- Asegúrese de que la posición vertical correcta de la sonda en el interior del baño de agua está en línea con lo señalado el marcado en el lado de la bañera.
- Mantenga centros del aplicador y el establo frasco en una línea horizontal.
- Activar el dispositivo de ondas de choque y aplicar los impulsos mientras se mantiene el matraz de cultivo, así como el aplicador en una posición estable durante todo el procedimiento.
5. Después del tratamiento
- Tome el frasco de cultivo fuera del baño de agua.
- Seque con toallas de papel comunes.
- Limpiar el matraz con precisión con agentes desinfectantes.
- Retire Parafilm sellado y la tapa.
- Pipetear la mediana dentro de los frascos a tubos centrífugos.
- Centrifugar apropiadamente. Parámetros de centrifugación dependen del tipo de célula utilizado,
- Añadir 5 ml de medio de cultivo celular al matraz. Resuspender el sedimento de células se centrifugó con 2 ml de medio de cultivo celular. Pipetear la suspensión en el matraz. Por lo tanto, fragmentos de células o células que pueden haber sido separados durante el tratamiento no se pierdan.
Trampas
- Preparación así como el tratamiento deben llevarse a cabo en condiciones estériles dentro de flujo laminar para evitar la contaminación del cultivo celular.
- Se recomienda una buena práctica de cultivo de células para evitar la contaminación de las sondas. En particular, la desinfección del exterior de los frascos es muy recomendable antes de ponerlos de nuevo a la incubadora. El baño de agua, así como el interior del agua, no es estéril!
- No conecte el calentador a la fuente de alimentación a menos que el baño de agua se llena con agua para evitar daños a las plexiglás baño construidas.
- Use una cantidad generosa de gel de ultrasonido sobre la apl onda de choqueicator para garantizar el acoplamiento adecuado y la propagación de ondas en el baño. Burbujas de aire de aire e incluso pequeñas absorben ondas de choque!
- Comprobar la posición de las sondas en el interior del baño de agua en relación con el aplicador para asegurar el tratamiento de toda el área de crecimiento.
- No mojar sondas demasiado profundo en el agua para evitar la contaminación.
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Representative Results
Usando el método descrito se aplicó ondas de choque a las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) que anteriormente aisladas de los cordones umbilicales. El cordón umbilical se obtuvieron de cesáreas electivas.
HUVECs fueron tratados en una confluencia de 90% en un matraz de cultivo de células T25 con un sistema de tratamiento con ondas de choque electrohidráulica. Los parámetros de tratamiento eran una densidad de flujo de energía de 0,1 mJ / mm 2 y una frecuencia de 5 Hz. 300 impulsos se aplicaron a una distancia de 5 cm de la fuente de ondas de choque a la capa de células.
La expresión de genes de Tie-2 (tirosina quinasa con dominios de inmunoglobulina-como y similares a EGF 2) ARNm se midió por análisis de PCR en tiempo real. Fue significativamente hasta reguladas en el tiempo (después de 2 horas SWT: 156,75 ± 14,49, 4 hr: 141.03 ± 9.71, 6 hr: 166,68 ± 2,15, p <0,05 vs CTR: 100.03 ± 7.5) Figura 5B. Este receptor angiopoyetina da una pista directa para endotelial c proliferación ELL y es un indicador de su capacidad hacia la angiogénesis. Como control positivo se utilizó poli (I: C) (ácido policitidílico poliinosínico) que, como se sabe un análogo estructura del ARN para estimular las células endoteliales (después de 2 horas SWT: 125,7 ± 10,08, 4 hr: 191.73 ± 5.15, 6 hr: 400,93 ± 19,62, p <0,05 vs CTR: 103,65 ± 6,18) Figura 5A.
Una matriz de citoquina se realizó 48 horas después del tratamiento para analizar principales citocinas inflamatorias IL-6 (59,97 ± 1,24, p <0,05 vs CTR 19,00 ± 0,44) e IL-8 (71,89 ± 1,52, p <0,05 vs 29,50 ± 0,87 CTR ) que están involucrados sustancialmente en la angiogénesis temprana. Ambos fueron significativamente mayor en el grupo de tratamiento como se muestra por la matriz de citoquinas Figura 5C y después de la cuantificación Figura 5D.
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Figura 1. Las ondas de choque aplicadas directamente en un frasco de cultivo celular. Cerca del 99% de las ondas se reflejan en la pared del fondo del matraz provocan así alteraciones físicas a las células y las próximas olas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Fase de desplazamiento de las ondas en el agua para el paso del aire. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Interferencias entre volver corriendo y se pueden producir ondas entrantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Representando el baño de agua IVSWT con la descripción de las partes más importantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5 (A) HUVEC estimuladas con el agonista de TLR-3 y el ARN estructura analógica Poly.. (I: C) y (B) de Tie-2 expresión de ARNm de onda de choque estimulado HUVEC que representa claramente un aumento significativo en la proliferación celular Los datos se dan como con la expresión de ARNm, media ± SEM. (C) los resultados de conjunto de citoquinas que muestra el aumento de los niveles de IL-6 e IL-8. (D) que representan la cuantificación de los resultados (densidad de píxeles) de serie de citoquinas, media ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 6. Esquema para la prueba piloto para identificar los parámetros de tratamiento perfecto para el tipo específico de célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La importancia del modelo propuesto para el tratamiento in vitro de la onda de choque es en el hecho de que las ondas pueden propagarse después de pasar el cultivo de células en contraste con los modelos existentes. De este modo, los efectos físicos perturbadores tales como fuerzas de tracción se pueden evitar. El modelo se asemeja más estrechamente las condiciones in vivo que por otros que la aplicación de ondas de sus frascos de cultivo celular directamente.
Una ventaja adicional es la posibilidad de variar la distancia entre la fuente de ondas de choque y las células. Esto no sería posible si el tratamiento de un matraz de cultivo directamente. Sin embargo, in vivo hay ciertas diferencias en la distancia entre el aplicador y la zona de destino, dependiendo de qué tan profundo dentro del tejido diana es. Al mismo tiempo se puede estudiar el efecto de las células que están en posiciones específicas a punto de enfoque de la onda.
La realización de los primeros experimentos
De acuerdo a nuestra experiencia con cardiomyocytes, células endoteliales, fibroblastos y células madre, cada tipo de célula necesita que sus parámetros de tratamiento específicos. Por lo tanto, recomendamos una prueba piloto para la evaluación de los parámetros de tratamiento adecuados antes de realizar los experimentos deseados. Este ensayo piloto necesita incluir diferentes distancias entre el aplicador de ondas de choque y la muestra, así como diferentes densidades de flujo de energía. También debe establecerse el número más adecuado de impulsos. La frecuencia de la aplicación de ondas de choque sigue siendo un motivo de preocupación - incluso en vivo. Un protocolo adecuado para un parámetro de tratamiento encontrar ensayo piloto se proporciona como un suplemento de la Figura 6.
El uso del recipiente de cultivo ideal es de gran importancia para el éxito del experimento. Preferimos matraces de cultivo de células comunes de cualquier tamaño. Sin embargo, puede haber razones para utilizar otros buques - por ejemplo a necesitar volúmenes más pequeños para llenar completamente el vaso durante el shock wave unplicación. Materiales adecuados desde el punto de vista acústico son PE (Z = 1'760'000 Ns / m 3), al caucho blando (Z = 1'270'000 Ns / m 3), poliamida (Z = 1'960'000 Ns / m 3). Menos ideal es PVC (3'270'000 Ns / m 3) de plexiglás (Z = 3'260'000 Ns / m 3) delrin (3'450'000 Ns / m 3) policarbonato (2'770'000 Ns / m 3) o polipropileno (2'400'000 Ns / m 3). No se utilizarán materiales duros tales como vidrio o metal.
Los pasos críticos
Definición de la distancia entre la fuente de ondas de choque y la muestra puede ser bastante complicado. La razón es que la fuente (por ejemplo, electrodos de consejos en un sistema electro-hidráulico) se encuentra dentro del aplicador. Por lo tanto, es necesario conocer la distancia desde la fuente hasta el manto aplicadores. Puede que tenga que pedir al fabricante del dispositivo de ondas de choque.
Una desventaja de este modelo es el hecho de que el vial de la cultura de células tiene que serlleno de medio de cultivo. Llenar los frascos de cultivo por ejemplo celulares implica un aumento del consumo y costoso de medio de cultivo. Además de los costos, este hecho también significa que todo lo que las células secretan está fuertemente diluido. La detección de moléculas, por tanto, se hace mucho más difícil debido a una disminución de la concentración. Por lo tanto, comenzamos a utilizar los filtros de proteínas para la centrifugación y por lo tanto aumentar la concentración de nuevo.
Además del uso de diferentes tipos de frascos de cultivo de células como se describió anteriormente, la principal modificación para IVSWT es su uso para el cultivo de tejidos y modelos ex vivo. En particular, nuestro grupo probado con excelentes resultados en el ensayo de angiogénesis anillo aórtico 10. Esto significa que es posible llevar a cabo cualquier tipo de tejido del órgano o de la ingeniería tisular injertos en el baño de agua IVSWT. Ex vivo aplicación de ondas de choque, por lo tanto, en el futuro podría ser utilizado para mejorar diferentes tipos de métodos de siembra de células en tejidos cultivados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Reiner Schultheiss y Wolfgang Schaden por su inspiración para este modelo. También agradecemos cristiana Dorfmüller por sus enormes esfuerzos todos los tiempos para apoyar nuestra investigación.
Muchas gracias a Robert Göschl y Hans Hohenegger de realización técnica cuidadosa de nuestras ideas!
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger - Technical Products | ||
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipettes 25 ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | ||
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 Cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| Mikrozid disinfectant | Schülke | ||
| 3.5 L Degassed water | |||
| Paper towels |
References
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