Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni
Summary
La parete cellulare batterica è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da peptidi. La cromatografia liquida ad alte prestazioni fornisce alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan. Presentiamo una procedura per l’isolamento delle pareti cellulari (sacculi) e la loro successiva preparazione per l’analisi tramite UPLC.
Abstract
La parete cellulare batterica è fondamentale per la determinazione della forma cellulare durante la crescita e la divisione e mantiene l’integrità meccanica delle cellule di fronte alle pressioni del turgore diverse atmosfere di grandezza. Attraverso le diverse forme e dimensioni del regno batterico, la parete cellulare è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da brevi peptidi. L’importanza centrale del peptidoglicano per la fisiologia batterica è alla base del suo uso come bersaglio antibiotico e ha motivato studi genetici, strutturali e biologici cellulari su come viene assemblato solidamente durante la crescita e la divisione. Tuttavia, sono ancora necessarie indagini approfondite per caratterizzare pienamente le principali attività enzimatiche nella sintesi del peptidoglycan e nella composizione chimica delle pareti cellulari batteriche. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è un potente metodo analitico per quantificare le differenze nella composizione chimica delle pareti dei batteri coltivati in una varietà di condizioni ambientali e genetiche, ma la sua produttività è spesso limitata. Qui, presentiamo una procedura semplice per l’isolamento e la preparazione delle pareti cellulari batteriche per analisi biologiche del peptidoglycan tramite HPLC e Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), un’estensione di HPLC che utilizza pompe per fornire pressioni ultra-elevate fino a 15.000 psi, rispetto ai 6.000 psi per HPLC. In combinazione con la preparazione delle pareti cellulari batteriche qui presentate, gli iniettori di campioni a basso volume, i rivelatori con alti tassi di campionamento, volumi di campioni più piccoli e tempi di esecuzione più brevi di UPLC consentiranno un’alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan e della biologia delle cellule batteriche fondamentali nella maggior parte dei laboratori biologici con accesso a un ultracentrifugo e UPLC.
Introduction
L’obiettivo del metodo descritto nel presente documento è quello di isolare le pareti cellulari batteriche intatte (sacculi) e di digerire il peptidoglycan (PG) in modo tale che la cromatografia liquida ultra-performance (UPLC) possa essere utilizzata per fornire informazioni come l’identità dei componenti muropeptidi e le loro concentrazioni, la lunghezza media dei filamenti di glicano e la frazione di materiale coinvolto nei collegamenti incrociati tra i trefoli. Per una discussione dettagliata della biochimica PG e delle specie di muropeptidi, ci sono diverse eccellenti recensioni che descrivono la struttura PG e il suo ruolo in infezione, resistenza, morfogenesi e crescita1-6. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per l’analisi PG è stata inizialmente sviluppata da Glauner e Schwarz negli anni ’80, e più recentemente è stata migliorata e applicata ampiamente nei laboratori di Miguel de Pedro e Waldemar Vollmer. I metodi precedenti utilizzavano l’analisi degli amminoacidi o la cromatografia su carta, tecniche dispendiose in termini di tempo e noiose che non producono valutazioni accurate o complete dei componenti della parete cellulare.
L’analisi UPLC può essere facilmente implementata in qualsiasi laboratorio di ricerca di base che abbia accesso a un ultracentrifugo e UPLC. Il metodo UPLC che presentiamo di seguito isola i sacculi completi, fornendo così informazioni complete e quantitative su tutte le specie chimiche in esso contenute. Questo metodo produce una quantificazione precisa di tutti i muropeptidi in una popolazione di batteri, il tutto entro una corsa UPLC di 20 minuti. L’implementazione di questo metodo comporta solo competenze di laboratorio di base, senza significativi investimenti finanziari nei materiali. Per eseguire i passaggi di questo metodo, i ricercatori devono solo essere esperti nella pipettazione, nella preparazione di tamponi ed enzimi e nella regolazione del pH, rendendolo accessibile a una vasta gamma di discipline scientifiche. La scelta degli enzimi utilizzati in questo protocollo dipende dalle specie di batterio analizzate; il protocollo qui descritto è utile per Escherichia coli, ed è stato generalmente trovato adeguato per isolare i sacculi da altri organismi Gram-negativi. La consultazione con la letteratura è raccomandata quando si applica questo metodo ai batteri Gram-positivi; in queste specie, la purificazione del sacculo è stata tradizionalmente più difficile. In particolare, questo metodo potrebbe essere necessario alterare in termini di scelta enzimatica e lunghezza dei tempi di digestione per adattarsi alle pareti più spesse e ai polimeri accessori come gli acidi teichoici dei batteri Gram-positivi. Il primo enzima in questo protocollo scide la lipoproteina della membrana esterna (come la lipoproteina di Braun, o Lpp) attacca al peptidogicano, rilasciando così tutto tranne il peptide C-terminale di- (o tri-) del Lpp dalla parete cellulare. Questo passaggio è necessario quando si esaminano enterobatteri, ma molti altri batteri Gram-negativi non hanno equivalenti Lpp, e quindi questo passaggio può essere saltato. Un secondo enzima si stacca specificamente dopo il componente dell’acido muramico del peptidoglycan, solubilizzando la subunità disaccaride che forma la specie muropeptide. Per fornire una valutazione accurata dell’architettura del PG, è necessario prestare attenzione a digerire i sacculi per evitare la scissione delle passerelle o di qualsiasi altra parte del gambo peptidico.
Sebbene le composizioni chimiche di peptidoglycan di oltre 100 ceppi di ~40 specie batteriche siano state analizzate dall’HPLC, non sono state eseguite analisi con la tecnologia UPLC. Inoltre, il lavoro precedente ha caratterizzato il peptidoglycan solo da una piccola frazione del dominio batterico, in parte limitato dalla produttività dell’HPLC. Pertanto, la diffusione di questo metodo al maggior numero possibile di ricercatori e l’implementazione su piattaforme UPLC saranno fondamentali per guidare studi fisiologici della grande frazione di specie batteriche il cui peptidoglycan deve ancora essere classificato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un passaggio critico di questa procedura è il passaggio 3.1 del secondo giorno di preparazione del campione. Se l’SDS è precipitato durante la notte o se i campioni sono stati conservati in SDS al 4% per diverse settimane a temperatura ambiente, i campioni devono essere riboiled per almeno 1 ora per riassolvere l’SDS. Una causa comune per la precipitazione dell’SDS è l’uso di mezzi con sali di potassio, quindi il potassio dovrebbe essere evitato nei mezzi se possibile. Come accennato nella sezione Risultati rappresent…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal New Innovator Award DP2OD006466 (a K.C.H.). Gli autori ringraziano Russell Monds per una dimostrazione pratica del metodo e per le discussioni scientifiche.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
Referências
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