초성능 액체 크로마토그래피에 의한 조성 분석을 위한 세균세포벽의 격리 및 준비
Summary
세균성 세포벽은 펩티드에 의해 교차된 당가닥의 거대 분자 네트워크인 펩티도글리칸으로 구성됩니다. 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피는 펩티도글리칸 조성물의 새로운 발견을 위한 고해상도 및 처리량을 제공합니다. 우리는 세포벽 (sacculi)의 격리와 UPLC를 통해 분석을위한 후속 준비를위한 절차를 제시합니다.
Abstract
세균성 세포벽은 성장과 분열 시 세포 모양의 결정에 중요하며, 강압에 직면하여 세포의 기계적 무결성을 유지합니다. 세균 왕국의 다양한 모양과 크기에 걸쳐, 세포 벽은 펩티도글리칸, 짧은 펩티드에 의해 교차 설탕 가닥의 매크로 분자 네트워크로 구성되어 있습니다. 세균 생리학에 대한 Peptidoglycan의 중앙 중요성은 항생제 표적으로 그것의 사용을 기초하고 성장과 분열 도중 강하게 조립되는 방법의 유전, 구조 및 세포 생물학 연구 결과를 동기를 부여했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 광범위 한 조사 는 여전히 완전히 펩 티도 글리칸 합성및 세균 성 세포 벽의 화학 구성에 주요 효소 활동을 특성화 하는 데 필요한. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 다양한 환경 및 유전적 조건하에서 자란 박테리아의 벽의 화학적 조성에 대한 차이를 정량화하는 강력한 분석 방법이지만, 처리량은 종종 제한적이다. 여기서, 우리는 HPLC및 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 통해 펩티도글리칸의 생물학적 분석을 위한 세균성 세포벽의 격리 및 준비를 위한 간단한 절차를 제시합니다, HPLC에 대한 6,000 psi에 비해 최대 15,000 psi의 초고압을 제공하기 위하여 펌프를 이용하는 HPLC의 확장. 여기에 제시 된 세균성 세포벽의 준비와 함께, 낮은 볼륨 샘플 인젝터, 높은 샘플링 비율을 가진 검출기, 더 작은 샘플 볼륨, UPLC의 짧은 실행 시간은 초음파 심분리기 및 UPLC에 대한 액세스 와 대부분의 생물학적 실험실에서 펩티도글리칸 조성 및 기본 세균 세포 생물학의 새로운 발견을위한 고해상도 및 처리량을 가능하게 할 것이다.
Introduction
본 명세서에 기재된 방법의 목적은 그대로 세균세포벽(sacculi)을 분리하고, 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피(UPLC)가 점혈구 성분의 정체성과 농도, 글리칸 가닥의 평균 길이 및 가닥 사이의 교차링크와 관련된 물질의 분획과 같은 정보를 제공하는 데 사용될 수 있도록 펩티도글리칸(PG)을 소화하는 것이다. PG 생화학 및 무로프타이드 종에 대한 상세한 논의를 위해, PG 구조와 감염, 저항, 형태 발생 및 성장1-6의역할을 설명하는 몇 가지 우수한 리뷰가 있습니다. PG 분석을 위한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 1980년대에 글라우너와 슈바르츠에 의해 처음 개발되었으며, 최근에는 미겔 드 페드로와 발데마르 볼머의 실험실에서 광범위하게 강화되고 적용되었습니다. 이전 방법은 아미노산 분석 또는 종이 크로마토그래피, 세포벽 성분의 정확하거나 완전한 평가를 산출하지 않는 시간 소모적이고 지루한 기술을 활용했습니다.
UPLC 분석은 초원심분리기 및 UPLC에 접근할 수 있는 모든 기본 실험실에서 쉽게 구현될 수 있습니다. 우리가 아래에 존재하는 UPLC 방법은 완전한 사쿠리를 분리하여 그 안에있는 모든 화학 종에 대한 포괄적이고 정량적 인 정보를 제공합니다. 이 방법은 박테리아의 인구에 걸쳐 모든 muropeptides의 정확한 정량화를 산출, 모두 20 분 UPLC 실행 내에서. 이 방법의 구현은 재료에 상당한 재정적 투자없이, 기본적인 실험실 기술을 포함한다. 이 방법의 단계를 실행하기 위해, 연구원은 파이펫팅, 완충제 및 효소를 준비하고, pH를 조정하는 데만 숙련되어 광범위한 과학적 분야에 접근할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 효소의 선택은 분석되는 박테리아의 종에 따라 달라집니다; 여기에 설명된 프로토콜은 대장균에유용하며 일반적으로 다른 그람 음성 유기체로부터 사쿠리를 분리하기에 적합한 것으로 나타났습니다. 문헌과의 상담은 그램 양성 균에이 방법을 적용 할 때 권장됩니다; 이 종에서, 타분 정화는 전통적으로 더 어려웠다. 특히, 이러한 방법은 그람 양성 균의 테이초크산과 같은 두꺼운 벽 및 부속품 폴리머를 수용하기 위해 효소 선택 및 소화 시간의 길이 측면에서 변경되어야 할 수 있다. 이 프로토콜의 첫 번째 효소는 펩티도글리칸에 부착된 외부 막 지단백(Braun의 지단백질 또는 Lpp)을 갈라서 세포벽으로부터 Lpp의 C-말단 디-(또는 트라이-) 펩타이드를 제외한 모든 것을 방출한다. 이 단계는 Enterobacteria를 검사할 때 필요합니다, 그러나 많은 그밖 그람 음성 박테리아에는 Lpp 등가물이 없습니다, 그러므로 이 단계는 건너뛸 수 있습니다. 두 번째 효소는 특히 펩티도글리칸의 무암산 성분 을 쫓아, 무로프티드 종을 형성하는 불각체 서브유닛을 용해한다. PG의 아키텍처에 대한 정확한 평가를 제공하기 위해, 크로스브릿지 또는 펩티드 줄기의 다른 부분의 분열을 방지하기 위해 사쿠리를 소화하는 데 주의를 기울여야 한다.
100종 이상의 세균성 종의 펩티도글리칸의 화학 조성물은 HPLC에 의해 분석되었지만 UPLC 기술로는 분석이 수행되지 않았습니다. 또한, 이전 작품은 세균 영역의 극히 일부만에서 펩티도글리칸을 특징으로 하며, 일부는 HPLC의 처리량에 의해 제한된다. 따라서, 가능한 한 많은 연구자에 이 방법의 보급, UPLC 플랫폼에 구현, 그의 펩티도글리칸아직 분류되지 않은 세균성 종의 큰 부분의 생리학적 연구를 구동하는 데 중요 할 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 절차의 중요한 단계는 샘플 준비 둘째 날의 3.1 단계입니다. SDS가 하룻밤 사이에 침전되었거나 실온에서 몇 주 동안 4% SDS에 샘플을 저장한 경우 샘플을 SDS를 재해석하려면 최소 1시간 동안 다시 끓여야 합니다. SDS 강수량의 일반적인 원인은 칼륨 염을 가진 매체의 사용입니다, 그래서 칼륨은 가능하면 매체에서 피해야한다. 대표 결과 섹션에서 언급했듯이, 또한 pH를 점동점(~3.5)의 등전점 내에서…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 디렉터의 새로운 혁신상 DP2OD006466(K.C.H.)의 지원을 받았습니다. 저자는 방법의 실질적인 데모와 과학적 토론에 대한 러셀 몬즈 감사.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
Referências
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