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Summary
DNabT 세포가 말초 T 세포 사이 드물다; 그러나, 그들은 특정 비 림프 조직에 풍부합니다. 비 림프 조직에서 DN T 세포를 분리의 어려움은 병태 생리 학적 중요성을 인식 증가에도 불구하고 자신의 기능 분석을 방해한다. 우리는 쥐의 신장에서 고순도 DN T 세포의 분리를 위해 새로운 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
비 림프 조직에서 DN T 세포의 분리를위한 표준 프로토콜은 다양한 면역 반응에서의 점점보고 참여에도 불구하고 현재 없습니다. DN T 세포는 allotransplants 1-6로 면역 및자가 면역 반응과 내성을 조절에 연루되어 고유 한 면역 세포의 유형입니다. DN T 세포는 말초 혈액 및 이차 림프 기관 (비장과 림프절)에서 드문,하지만,하지만, 정상적인 신장의 주요 거주자입니다. 아주 작은 인해 주변에서의 소수 자신의 병태 생리 학적 기능 7에 대한 알려져있다. 우리는 최근에 정상 상태 및 허혈 재관류 손상시 신장 8이 인구의 포괄적 인 표현형 및 기능 분석을 설명했다. DN T 세포 기능 분석을 크게 신장에서의 그들의 분리를위한 프로토콜을 개발함으로써 강화 될 것이다.
여기, 우리는 isolatio 수있는 새로운 프로토콜을 설명뮤린 신장으로부터 고순도 AB CD4 + CD8 + T 세포 및 DN T 세포의 N. 간단히 말해서, 우리는 콜라게나 제를 사용하여 신장 조직을 소화하고 밀도 구배에 의해 신장 단핵 세포 (KMNC)를 분리. 이것은 KMNC에서 70 %로 3 %에서 조혈 T 세포를 풍부하게하기 위해 두 단계로 이어진다. 첫 번째 단계는 CD45 + 분리 키트를 사용하여 조혈 세포의 포지티브 선택으로 구성된다. 두 번째 단계에서는, DN T 세포는 부정적인 CD4, CD8, 및 MHC 클래스 II 단일 클론 항체 및 CD1D α-galcer 량체를 사용하여 원하지 않는 세포의 제거에 의해 격리됩니다. 이 전략은 90 % 이상 순수 DN T 세포의 인구에 이르게한다. FACS 분석이어서 상기 항체 표면 염색은 순도를 확인하기 위하여 사용된다.
Introduction
주변 αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - 이중 부정은 (DN) T 세포는 별개의 표현형과 기능 1-4을 가지고 다양한 하위 집합으로 분할된다. DN T 세포는 제대로 이해하고 있지만 점점 다른 질병 모델 4-6의 병태 생리 학적 면역 반응에 연루된다.
DN T 세포는 점점 더 다양한 면역 및자가 면역 반응의 조절과 이식 실험 관용의 변조에 연루되는 고유 한 면역 세포의 유형입니다. 4-6, 9 그들은 비장과 림프절 (말초 혈액 및 이차 림프 기관에 드문 ). 그러나, 그들은 정상 신장 및 소화관 상피 10-12의 주요 거주자. 약간은 정상 상태에서의 신장에서의 기능 7에 대해 이러한 신장 transpl과 관련된 급성 신장 손상 (AKI)과 같은 병적 인 조건에서 알려져있다개미.
이 때문에, 각 플레이어의 역할을 정의 alloresponses 포함한 면역 반응을 조절하는 다른 면역 세포의 복잡한 역할은 alloresponses 승낙 새로운 치료제를 설계하는데 중요하다. 생리적 및 다양한 질병 상태에서 신장에 존재 DN T 세포의 상당수 감안 DN T 세포는 이식 수혜자에서 중요한 마우스 및 인간 면역 및자가 면역 반응을 조절하는데 역할 및 alloresponses 재생할 가능성이있다. 아직도 흩어져있는 증거 불구하고 축적하는 것은 모두 병원성 및 면역 기능에 DN T 세포를 연루하지만, 왜, 어떻게 그들이 특정 유해하거나 억제 기능을 발휘하고 환경 영향을 그들이 어떻게 그것을 제대로 이해된다.
때문에 신장에서의 낮은 풍요, 분리의 개선 된 방법이 필요합니다.
t에서 DN T 세포의 분리를위한 표준 프로토콜은 없습니다그는 비 림프 조직. 우리 프로토콜은 신장에서 DN T 세포의 분리를위한 신규 한 방법을 설명한다; 그러나, 상기 방법은 또한 다양한 비 - 림프 조직을 위해 사용될 수있다.
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Protocol
1. 악기의 제조, 문화, 미디어 및 시약
- 상품 : 무균 조건 하에서 시약을 준비하고 층류 후드를 사용합니다.
- 소 태아 혈청의 5 %, 수소 나트륨 2.1 g, 10 ㎖ 글루타민산 100 배, HEPES 10 ㎎, 1 밀리그램의 나트륨 피루 베이트 10 ㎖를 100 배의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가, RPMI 조직 배양 배지 1 L를 준비합니다.
참고 : 권장되는 조직 배양 배지, RPMI는 DMEM에 교환 할 수있다. - 5 % 콜라게나 "D"솔루션 (조직 문화 매체의 10 ML에 콜라게나 "D"5 ㎖)을 준비합니다.
- 100 %, 80 % 및 40 %의 세 가지 다른 농도에서 퍼콜 솔루션을합니다. 다음의 농도는 1 샘플에 대해 계산됩니다. 실온에서 솔루션을 유지합니다.
- 퍼콜 용액 (원액부터) 희석 퍼콜 9 ML을 추가합니다; PBS 배 1 ㎖를 추가합니다.
- 퍼콜 솔루션 :; 퍼콜 8 ㎖를 100 % 추가 PBS 1X 2 ㎖를 추가합니다.
- 퍼콜 솔루션 :퍼콜 80 % 4 ㎖를 추가; PBS 1X 4 ㎖를 추가합니다.
- (FACS) 버퍼를 정렬 형광 활성화 된 셀의 1 L를 확인; 5 ML 10 % BSA (0.1 % BSA), 1 ㎖의 10 % 아 지드 화 나트륨 (0.1 %), 2 ㎖ EDTA 에이전트, 1X PBS 1,000 ml로 구성을 추가합니다.
신장 소화의 2. 준비
- , 필요한 기관 승인을 획득 한 표준 방법으로 쥐를 희생에게서 피를 뽑다 현재 규정 및 동물 관리 지침에 따라 한.
- 펜토 바르 비탈 (0.07 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취.
- 일어난 과다 출혈로 넘어갑니다.
- 수술대에 누운 위치에 마우스를 놓습니다.
- 70 % 에탄올과 복부 영역 스프레이.
- 페트리 접시에 콜라게나 D 솔루션의 10 ML을 추가합니다.
- 제거하고 각 마우스 모두에서 신장을 디 캡슐.
- 에 흉골의 복부 피부와 복막을 통해 중간 선 절개를함으로써 abdomimal 구멍을 엽니 다치골.
- 측으로 측방 부위를 이동하여 좌측 신장을 노출.
- 조심스럽게 집게로 왼쪽 캡슐을 분리합니다.
참고 : 캡슐은 신장을 둘러싸고있는 투명한 층으로 나타납니다 부분적으로 perinephric 지방 조직에 의해 덮여. - 수술 가위를 사용하여 척추 경 혈관을 절단하여 왼쪽 신장을 제거합니다.
- 오른쪽 신장에 대해 동일한 절차를 반복합니다.
참고 : 오른쪽 신장은 더 많은 두개골과 중간 선 (작은 꽃자루가 짧다)에 더 가깝다.
- 페트리 접시에 신장을 놓습니다.
- 일반 금속 형성 블레이드를 사용하여 작은 조각으로 신장 조직 (치수 1 ~ 2 mm)를 절단하고 (그림 1) 37 ° C에서 인큐베이터에서 30 ~ 45 분 동안 콜라게나 솔루션으로 조각을 배치합니다.
신장의 소화에서 신장 단핵 세포 (KMNC) 3. 준비
- 신장의 세포 현탁액을 얻을기계적 조직 배양 배지 25 ㎖에 스트레이너 (70 μm의)와에 resuspend를 사용하여 혼합 조직을 방해하여 소화.
- 세포 현탁액을 펠렛 4 ° C에서 10 분 400 XG에 원심 분리기.
- 아주 천천히, 조심스럽게 40 % 퍼콜 용액 4 ㎖의 펠렛을 다시 일시 중단하고 부드럽게 전달 플라스틱 피펫으로 80 % 퍼콜 용액 4 ㎖에 오버레이. 이것은 분명히 반투명 층에 의해 분리 된 두 개의 단계가 발생합니다. 상단에있는 지질에 해당하는 노란색 층이 될 것입니다.
- 브레이크 오프 모드에서 원심 분리하여 실온에서 30 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리기.
- 흡인에 의해 노란색 두꺼운 꼭대기 층 (약 1 ~ 2 ㎖) 제거합니다.
- 전송 피펫을 가진 두 단계의 인터페이스 만 약간의 흰 반투명 레이어를 수집합니다. 아주 조심스럽게 조직 배양액 2 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 원뿔형 튜브에이 현탁액을 전송하고 총 부피를 만들기 위해 배지 13 mL를 넣고15 ML.
- 4 ℃에서 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기
- 배지 1 ㎖에 샘플에 resuspend.
- 혈구에 트리 판 블루 배제를 사용 KMNC의 수를 계산 및 신장 당 ML 당 KMNC의 숫자로 결과를 표현한다.
- 한 번 상기와 같이 씻는다.
KMNC에서 4. 조혈의 분리 (CD45의 +) 세포 (단계 I)
- 버퍼를 실행의 90 μL에 10 7 세포를 재현 탁.
- CD45 마이크로 비즈의 10 μl를 추가하고 4 ℃에서 15 분 동안 품어
- 반응을 정지 실행 버퍼 1 ML을 추가합니다. 버퍼를 실행 500 μL에서 4 ° C와에 resuspend에서 10 분 400 XG에 원심 분리기.
- 자석에 배치하여 자기 열을 준비하고 버퍼를 실행의 3 ㎖로 씻어.
- 자기 칼럼을 통해 세포 현탁액을 통과하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다.
- runn 3 ㎖의 세포를 세 번 씻으십시오버퍼를 보내고. 그런 다음 유출 물을 수집합니다.
- 분리 및 피펫 열에 버퍼를 실행 5 ㎖에서 열을 제거하고 즉시 표시된 부분을 세척하십시오. 이 부분은 CD45 + 세포가 포함되어 있습니다. 세포를 계산합니다.
- 신장에 다른 T 세포 아형의 절대 수를 계산하는 것은 유동 세포 계측법에 의해 결정 양성 세포의 비율 (도 2)에 의해 KMNC의 총 수를 곱한다.
음의 선택에 의해 CD45 + 준비에서 DN T 세포 5. 절연 (단계 II)
- 다음 비오틴 항체의 각 2.5 μL (0.5 ㎎ / ㎖, 1.25 μg) 추가 : 안티 - CD4, 항 CD8, 안티-FC 수용체 (CD16/32을), 안티 MHC 클래스 II (IA의 B), 안티 - 매 10 7 조혈 세포에 대한 CD1D PBS-57 량체.
- 차가운 방에서 30 분 동안 세포를 품어.
- 1 ㎖ 안티 - 비오틴 마이크로 비드를 추가합니다.
- 추운 방에서 30 분 동안 품어.
- t에 튜브를 놓고그는 자석과 고갈로 진행합니다.
- 혈구를 사용하여 음의 분획 DN T 세포의 총 수를 결정하는 생세포 횟수.
- 제 1 게이트 CD45의 +, 제 2 게이트 TCRαβ +이 게이팅 전략에 따라 유동 세포 계측법과 DN T 세포의 순도를 확인합니다. CD1D + 세포를 제외합니다. CD8 + 대 플롯 CD4 +는 DN T 세포 (그림 3)를 식별합니다.
- 순도 결정된 비율로 총 수를 곱한다.
참고 : 90 % 이상 순수 DN T 세포의 인구에이 프로토콜의 결과를 사용하여.
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Representative Results
야생형 C57BL / 6 (B6) 신장 신장 당 약 1.5-2.1 × 10 6 단핵 세포가 포함되어 있습니다. 약 10 % 미만은 조혈 CD45 + 세포 수 있습니다. 5 % 콜라게나 제를 사용하여 분해 한 다음도 1에 나타낸 바와 같이 신장 단핵 세포 (KMNC)의 제조에 대하여, 신장이 작은 조각으로 절단된다.
이것은 KMNC 층 (도 2, 왼쪽 패널) 수집하는 밀도 구배 원심 분리를 수행하여 이어진다. KMNC은 다음 섹션 4 (단계 I)의 설명에 따라 CD45 + 자기 마이크로 비드를 사용하여 긍정적 인 선택을 하였다. 컬럼 바인딩 균체 후 FACS로 용출하고 CD45 +에 대해 분석 하였다. 이 유동 세포 계측법 (그림 2, 가운데 패널)에 의해 분석으로 약 80~95%에 CD45 + 세포의 농축에서 발생합니다. 농축 된 CD45 + 조혈 세포 중, 약 40 % ~ 60 %가 TCR + (미도 데이터) αβ이고, 약 30-60%은 DN T 세포 (그림 2, 오른쪽 패널)이었다.
CD4 +, CD8 +, MHC 클래스 II +와 비오틴 특정 단클론 항체 및 안티 - 비오틴 마이크로 비드 및 자기 열을 사용 CD16/32 + 세포에 라벨을 제거하기 위해 음의 선택에 충실 CD45 + 세포를 쓰는 포함하는 마지막 단계. (그림 3) DN T 세포 (90 % -95 %) 고도로 정제에서이 결과. 이 프로토콜 다음은 0.5 × 10 6 조혈 CD45 + 마우스 (두 개의 신장) 기준 자기 표시된 셀을 얻을 수 있었다.
그림 1. 5 % 콜라게나 솔루션 소화 신장의 제조. 마우스의 신장이 1-2밀리미터의 작은 조각으로 절단 및 발굴을위한 30 분 콜라게나 D 5 % 용액에 배치됩니다estion. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 신장에서 CD45 + 조혈 세포의 농축 그림 2 전략 왼쪽 :.. 긍정적 인 선택에 의해 CD45 + 키트를 사용하여 농축 전에 신장 MNC의 CD45 염색 센터 : 긍정적 인 선택에 의해 CD45 + 키트를 사용하여 농축 한 후 신장 MNC의 CD45 염색 오른쪽. : 게이트 CD45 + 세포 T 세포의 다른 부분 집합들 사이 αβTCR + 세포의 CD4 및 CD8의 프로필. 이 인터넷의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오gure.
. 격리 된 DN T 세포의 그림 3 순도 왼쪽 :. 음의 선택에 의한 절연 신장 DN T 세포의 CD45 염색 센터 :.. 음의 선택에 의한 절연 신장 DN T 세포의 TCRαβ 염색 오른쪽 : 격리 된 DN T 세포 중 CD4 및 CD8 염색 음의 선택. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
정화하기 전에 신장에서 4. 림프구 그림.
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Discussion
그들은 같은자가 면역 질환, 암, 이식 허용, 급성 신장 손상 (AKI)을 포함하여 신장의 주요 질환과 같은 다른 병리학 적 조건에 연루되고 있기 때문에 DN T 세포에 대한 관심이 증가가, 8, 13 사구체 신염. 따라서, 더 나은 DN T 세포의 병태 생리 학적 기능을 이해 및 특성화가 필요하다. 그러나, 현재 CD4와 CD8 T 세포에 비해 이러한 세포의 기능에 대한 이해의 부족이있다. 가장 큰 이유는 차 림프 기관의 DN T 세포의 소수 따라서 체외 분석 및 입양 전송 실험을위한 충분한 세포를 얻기에 어려움이 있습니다. DN T 세포는 주로 신장 (8)과 같은 비 림프 조직에 있습니다 만, 고체 기관에서 자신의 격리를위한 신뢰할 수있는 방법의 부족은 그 기능을 조사하는 노력을 방해한다. 따라서, DN T 세포의 분리를위한 우리의 새로운 프로토콜신장에서의 DN은 T 세포의 기능에 대한 연구를 촉진 할 것으로 예상된다. DN T 세포와 Fas 결핍 (LPR) 또는 FasL의 결핍 (GLD) 생쥐에서 많은 수있는 림프절에 축적하고 쉽게 림프 기관 (9), (14), (15)로부터 분리 될 수 있지만, 여전히 다른에서 이들 세포를 분리 할 과제로 남아 조직.
이 프로토콜에 따라,이 마우스의 신장은 대략 0.5 × 106 조혈 세포 (CD45 +) 및 주변의 0.2 × 106 DN T 세포를 얻었다. 이 숫자는 체외 배양, 기능 분석 및 / 또는 FACS 분석에서 수행하기에 충분하다. DN T 세포 인구의 순도는 유동 세포 계측법에 의해 확인되어야한다. 이 프로토콜은 98 %로 순수 할 수 있습니다 DN T 세포의 인구를 제공합니다. 이 프로토콜은 신장에서 DN T 세포의 분리를 위해 설계되었지만, 다른 비 림프 기관에서 T 세포의 분리에 대해 수정 될 수있다 마음으로, 갑상선 등
DN T 세포가 작은 모집단을 대표하기 때문에, 정제의 추가적인 라운드를 수행함으로써 수율을 증가시키기 위해 종종 필요하다. DN T 세포의 높은 숫자가 (이상 0.5 × 10 6 세포)를 요구되는 경우, 우리는 시간 및 시약 비용을 감소시키기 위해 분리를 선별 수행 추천합니다.
요약하면,이 프로토콜은 신장에서 DN T 세포의 분리를위한 신규 한 방법을 설명한다. 그것은 긍정적 인 선택하고 원하지 않는 세포 인구의 고갈에 대한 부정적인 선택에 의해 다음 단계 (소화 KMNC의 농축을 통해) 준비로 구성되어있다. 따라서, 분리 공정 동안 DN T 세포의 최소한의 직접적인 조작이있다. 이 마우스 및 인간의 말초 혈액에서 종래 T 세포의 분리를 위해 사용되는 것과 유사한 이차 림프 기관에서 DN T 세포의 분리를위한 기존의 프로토콜이 있다는 것을 주목할 필요가있다.
ove_content "> 그것이 어떤 DN T 세포의 FcR-γ를 표현하는 것으로 나타났습니다 때문에, 다른 옵션은 칵테일 16, 17 CD16/32 +를 포함하지 않는 것입니다. DN T 세포의 성공적인 분리 세부 사항에 큰 관심이 필요합니다. 특히 중요 단계는 다음과 같습니다 조직 소화, 작은 조각으로 신장 조직의 절단, 정확하게 식별하고 밀도 구배에 가벼운 층을 수집을 전반적으로, 연습과 약간의 손재주 몇 차례가 원하는 결과를 달성하기 위해 필요합니다..Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH PBS (R21 AI095484)에 의해 지원된다. 우리는 CD1D 량체를위한 NHI의 테트라 핵심 시설을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37 °C with 5% CO2) | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-MHC class II (I-A b) biotinylated | BD | 553609 | |
| AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys - Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| CD1d α-galcer tetramer | NHI |
References
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면역학 제 87 더블 네거티브 (DN) αβ T 세포 CD45 + T 세포의 분리 신장 림프구 비 림프 조직 T 세포 정화 허혈 재관류 상해 급성 신장 손상 조직 주민 림프구 림프구 증식 질환 홍 반성 루푸스Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
