Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme
Summary
Stres granüller (SGS) takılmıştır ribonükleoprotein parçacıklar (RNP) ve çeşitli gerilimlere, hücresel yanıt olarak önemli sitoplazmik RNA ihtiva eden granüller bulunmaktadır. SG-Dinamiği stresten sonra transfekte primer hücrelerde SGS etiketli bileşeninin lokalizasyonu görselleştirerek canlı hücrelerde takip edilebilir.
Abstract
SGS spesifik protein bileşenlerinin ya da poli A + mRNA immuno hücrelerinde görselleştirilebilir. SGS son derece dinamik ve bunların montaj ve kader çalışma stres hücresel yanıtı anlamak önemlidir. G3BP (RasGAP SH3 alanı Binding Protein) gibi SGS önemli faktörler eksikliği fareler ve Merkezi Sinir Sistemi değişiklikler gelişim kusurlarına yol açar. Bir organizmanın, bir kutu kültürü birincil hücrelerden hücrelerde SG-dinamiklerini incelemek ve SGS transfekte etiketli bileşenin lokalizasyonu izleyin. Biz Fare Embriyonik Fibroblastlar G3BP1 içeren SGS (MEF'ler) gözlemlemek için time-lapse deneyi tarif. Bu teknik aynı zamanda, yakın zamanda, bu SGS Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı oluşan göstermiştir gibi önemli olan, canlı nöronlar G3BP içeren SGS incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, başka bir hücre gövdesi ve granül protein bileşeni üzere uyarlanmış ve yapılabilirtransgenik hayvanlar, bu granüller belirli bir faktör yokluğunda, örneğin granüller dinamiklerinin canlı bir çalışma sağlar.
Introduction
Stres granüller (SGS) gibi yüksek bir sıcaklıkta, oksidatif stres, hipoksi, ozmotik şok, UV ışınlama, glikoz yoksunluğu, ya da viral enfeksiyon 1. çevresel strese, bir hücre koruyucu bir cevap olarak meydana olmayan zar sitoplazmik odak noktasıdır. Bu, oksidatif stres tetikler sodyum arsenit gibi bileşikler ile muamele ile kimyasal olarak indüklenebilir. SGS durdu çeviri tutuklandı haberci ribonükleoprotein (mRNPs) birikir öteleme makine gelen mRNA'larını kenetleyerek, 2 kompleksleri ve bunların montaj eIF2α fosforlaştırılmasına (ökaryotik başlatma faktörü 2 α) tarafından tetiklenebilir. SGS P-organları gibi polisomlar ve diğer tanecikler ile bileşenler alışverişinde dinamik yapılardır. Onlar mRNAlar sıralanır ve stabil olmayan polysomal mRNPs 3 çevrilmesinden, yeniden başlatılması, bozulması, veya paketleme ya için işlenen bir "triyaj merkezi" oluşturmaktadır. SGS montajı hızlı but daha büyük granüller halinde birleşerek ilk sayıda küçük agrega ile aşamalı bir süreçtir. Mikrotübülleri stabilize bozmak veya kimyasal inhibitörlerinin kullanımı, mikrotübül ağı tertibatı olup, birleşme ve demontaj işlemleri dahil SG dinamikleri için gerekli olduğunu göstermektedir.
SG-dinamik tertibatı aynı zamanda TIA-1 (T-hücresi iç antijen-1) ve RNA gibi özel bağlayıcı proteinlerin (RNA-BP) agregasyonu ile yükseltilir TIAR dimerize edebiliyoruz (TIA-1 ile ilişkili protein), ve SG-4 içine Polizom demontaj ve mRNAların yönlendirme teşvik. G3BP (RasGAP SH3 alan bağlayıcı protein) hücreleri arsenit yüksek sıcaklık ve stresli ve imalatçının talimatlarına G3BP aşırı ifadesi SGS montaj 5 uyarabilir zaman SG-lokalize bu tür bir RNA-BP olan.
G3BP ilk RasGAP p (a-Ras GTPaz aktive edici protein ile etkileşim yoluyla karakterize edildi evrimsel olarak muhafaza edilmiş bir RNA-BP120 6); ancak bu etkileşim son zamanlarda 7 dönülmüş oldu. G3BP ailesi iki memelilerde üyeleri, G3BP1 (G3BP olarak anılacaktır) ve G3BP2 8 içerir. Hücreler strese 9 tabi olduğunda her iki proteinin de, SGS de colocalize. Kanonik RNA-tanıma Motif (RRM) korunmuş RNP1 ve RNP2 motifli: G3BPs bir N-terminal domain NTF2 prolin açısından zengin (PxxP) motifleri, ardından da lokalizasyonu ve oligomerizasyon, etkilemek için önerilen ihtiva eder, daha sonra C-terminal motifi RNA bağlama ile ilişkili , bir arginin-glisin zengin (RGG) kutusu izledi. İlginç bir şekilde, EGFP kaynaşmış farklı etki oluşturarak bu proteinin farklı parçaların analiz NTF2-benzeri domain ve RNA-bağlama alanı en verimli şekilde dimerizasyonunun özelliklerinin önemini işaret, SGS alınmış ve RNA bağlama olduğunu göstermiştir SG-montaj. Çeşitli in vitro modelleri 10-13 içinde G3BP proteinlerin farklı işlevler ortaya koymuştur.Farelerde G3BP bozulması gelişim büyüme ve hayatta kalma 14, hem de uzaysal çalışma belleği 15'te ataksi ve bozuklukları ile karakterize olan Merkezi Sinir Sistemi (CNS) içinde G3BP için önemli bir rol bu proteinin önemini göstermiştir. G3BP eksikliği SG oluşumu ve nörodejeneratif hastalıklar 15 arasında doğrudan bir bağlantı kurarak, değişmiş nöronal plastisite ve kalsiyum dengesindeki yol açar. Bu nöronlar gibi primer hücrelerde SG-dinamiklerini incelemek edebilmek için bu nedenle önemlidir.
Bu protokol arsenit tedavi altında primer hücrelerde G3BP1 içeren SG-montajını gözlemlemek için basit bir yol sağlar. Bu gerilmeler, örneğin farklı türde, farklı koşullar altında SGS montaj incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, SGS diğer granüller veya diğer bileşenler için adapte edilebilir. Nitekim, bu protokol G3BP1 üzerinde duruluyor, ancak TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2 gibi diğer stres granülleri belirteçler vardırFMRP (Fragile X Mental Retardasyon Sendromu protein) 16, TDP-43 (transactive yanıtı DNA bağlayıcı protein 43) 17 veya 18 Staufen. Özellikle, TIA-1 / R benzeri proteinler aşırı ekspreyonlandıkları zaman farklı oluşan SGS fonksiyonu, düzenlenmesi ve ilgili transkript farklı olsa bile, montaj SGS uyarabilir RNA bağlayıcı proteinler çekirdek, G3BP benzerleridir. SG-bu önemli bileşenlerinden herhangi birini veya çekirdeği oluşturucu bir flüoroforla etiketli versiyonu transfeksivonu görüntü özellikle SGS montaj ve dinamiklerine yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol endişe transfesktiyonu ve dikkatle sitotoksisite aşağı düşürmek için kontrol edilmesi gereken daha özel zaman atlamalı satın almalar, en kritik adımlar.
Primer hücre kültürü sürece steril koşullarda muhafaza edilir ve dikkatli diseksiyon ve hücre ayrışma adımları sırasında zarar görmesini önlemek için alınır gibi, zor bir parçası değildir. MEF'ler erken pasajlara donmuş muhafaza edilebilir. Kalsiyum fosfat ile transfeksiyon iyi Neuron 21,</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar satın almalar yapıldı Montpellier Rio Görüntüleme (MRG) platformu kabul etmek istiyorum. Onlar protokol farklı yerlerinde kendi yardım için Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot ve Virginie GEORGET teşekkür ederim. Bu çalışma la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745) Fondation tarafından dökün desteklenmiştir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Pre-warm at 37 °C |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Non essential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Pre-warm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Pre-warm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0,1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
Referências
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
- Tourrière, H., et al. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).
- Parker, F., et al. A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).
- Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1. PLOS ONE. 6 (12), (2011).
- Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies. Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).
- Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress. PLOS ONE. 7 (4), (2012).
- Tourrière, H., et al. RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).
- Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway. Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).
- Solomon, S., et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).
- Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease. Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).
- Zekri, L., et al. Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP. Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).
- Martin, S., et al. Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons. Journal of neurochemistry. , (2013).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Colombrita, C., et al. TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult. Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).
- Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly. Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).
- Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Current protocols in neuroscience. 3, (2001).
- Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation. Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).
- Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).
