حبيبات الإجهاد (اس جي اس) هي حبيبات الحمض النووي الريبي حشوية تحتوي على جزيئات بروتين نووي ريبوزي المتعثرة (RNPs)، والمهم في الاستجابة الخلوية لمختلف الضغوط. يمكن اتباعها ديناميات SGS في الخلايا الحية من خلال وضع تصور توطين عنصر الموسومة اس جي اس في الخلايا الأولية transfected بعد الإجهاد.
SGS يمكن تصور في الخلايا المناعية التي كتبها مكونات بروتين معين أو بوليا + mRNAs و. SGS هي ديناميكية للغاية ودراسة جمعيتهم ومصير المهم أن نفهم الاستجابة الخلوية للإجهاد. نقص في العوامل الرئيسية لمثل SGS G3BP (RasGAP SH3 مجال بروتين ملزمة) يؤدي إلى عيوب التنموية في الفئران والتعديلات في النظام العصبي المركزي. لدراسة ديناميات SGS في الخلايا من كائن حي، يمكن للمرء الخلايا الأولية الثقافة واتبع توطين عنصر الموسومة transfected من SGS. نحن تصف التجربة الوقت الفاصل بين لمراقبة SGS التي تحتوي على G3BP1 في الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs). ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لدراسة SGS التي تحتوي على الخلايا العصبية في G3BP الحية، وهو أمر حاسم كما تبين مؤخرا أن هذه SGS تتشكل في ظهور الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر. يمكن تكييفها هذا النهج تجاه أي من مكونات أخرى من الجسم الخلوية والبروتينات الحبيبية، وأجرىمع الحيوانات المعدلة وراثيا، والسماح للدراسة حية من حبيبات ديناميات على سبيل المثال في حالة عدم وجود عامل معين من هذه الحبيبات.
حبيبات الإجهاد (اس جي اس) هي بؤر حشوية غير الغشائي شكلت كرد الخلوية واقية للإجهاد البيئي، مثل درجة حرارة مرتفعة، الاكسدة، نقص الأكسجة، صدمة التناضحي، الأشعة فوق البنفسجية، والحرمان من الجلوكوز، أو عدوى فيروسية 1. أنها يمكن أن يتسبب كيميائيا عن طريق العلاج مع مركبات مثل الزرنيخ الصوديوم، والذي يطلق الاكسدة. اس جي اس تتراكم المتوقفة ترجمة القبض رسول بروتين نووي ريبوزي (mRNPs) مجمعات 2، عزل من mRNAs والآلات متعدية، ويمكن أن تسبب التجمع من قبل الفسفرة من eIF2α (بدء حقيقية النواة عامل 2 α). SGS هي هياكل دينامية تبادل المكونات مع polysomes وحبيبات أخرى مثل الهيئات-P. أنها تشكل "مركز الفرز" حيث يتم فرز mRNAs ومعالجتها وإما ترجمة، باستعادة وتدهور، أو التعبئة والتغليف في غير مستقرة mRNPs polysomal-3. تجميع SGS سريع بالتحرير هو عملية تدريجية مع العديد من المجاميع الصغيرة الأولية التي تتجمع في حبيبات أكبر. استخدام مثبطات الكيميائية التي تعطل أو استقرار الأنابيب الدقيقة تبين أن الشبكة أنيبيب هو مطلوب لديناميات SG بما في ذلك عمليات التجميع، التحام والتفكيك.
يتم الترويج لتجميع حيوي من SGS أيضا تجميع البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي محددة (RNA-BP) مثل TIA-1 (T-الخلية الداخلية مستضد-1) وTIAR (البروتين المتصلة TIA-1)، والتي هي قادرة على dimerize وتعزيز polysome التفكيك والتوجيه من mRNAs وإلى SGS 4. G3BP (RasGAP SH3 مجال البروتين ملزمة) مثل هذا RNA-BP أن يموضع لاس جي اس عندما تتعرض لإجهاد الخلايا مع الزرنيخ أو ارتفاع في درجة الحرارة، وoverexpression من G3BP dephosphorylated يمكن أن تحدث SGS التجمع 5.
G3BP هو الحفاظ تطويريا RNA-BP التي تميزت في البداية من خلال تفاعلها مع بروتين تفعيل رأس GTPase (ع RasGAP120 6)؛ ولكن هذا التفاعل تم مؤخرا إعادة النظر 7. ويشمل الأسرة G3BP عضوين في الثدييات، G3BP1 (المشار إليها باسم G3BP) وG3BP2 8. كل من البروتينات colocalize في اس جي اس، عندما تتعرض الخلايا للإجهاد 9. تشمل G3BPs اقترح مجال NTF2 N-محطة للتأثير على توطين وoligomerization، تليها البرولين الغنية (PxxP) الزخارف، ثم الزخارف C-محطة المرتبطة الحمض النووي الريبي ملزمة: الكنسي RNA-التعرف على الحافز (RRM) مع الحفظ RNP1 والزخارف RNP2 ، تليها الغنية (RGG) مربع أرجينين الجلايسين. ومن المثير للاهتمام، وأظهر تحليل أجزاء مختلفة من البروتين عن طريق بناء مختلف المجالات لتنصهر EGFP أن NTF2 مثل النطاق والمجال ملزم RNA كانت جندت أكثر كفاءة لSGS، مما يدل على أهمية خصائص dimerization والحمض النووي الريبي ملزمة في تجميع SGS. وقد كشفت نماذج متنوعة وظائف مختلفة من البروتينات G3BP في المختبر 10-13.وقد أظهرت اضطراب G3BP في الفئران أهمية هذا البروتين في النمو والبقاء على قيد الحياة 14 التنموية، فضلا عن الدور الهام للG3BP في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وتتميز ترنح وعيوب في الذاكرة العاملة المكانية 15. نقص G3BP يؤدي إلى تغير الخلايا العصبية اللدونة والكالسيوم التوازن، وإقامة صلة مباشرة بين تشكيل SG وأمراض الاعصاب 15. بالتالي فمن المهم أن تكون قادرة على دراسة ديناميات SGS في الخلايا الأولية مثل الخلايا العصبية.
يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة لمراقبة تجميع المحتوية على G3BP1 SGS في الخلايا الأولية تحت العلاج الزرنيخ. ويمكن استخدامه لدراسة SGS التجمع في ظل ظروف مختلفة، على سبيل المثال أنواع مختلفة من الضغوط. فإنه يمكن أيضا أن تتكيف مع حبيبات أو غيرها من المكونات الأخرى من SGS. في الواقع، ويركز هذا البروتوكول على G3BP1، ولكن هناك علامات أخرى حبيبات الإجهاد مثل TIA-1 / R، TTP (tristetraprolin) 2،FMRP (X الهشة تخلف العقلي متلازمة البروتين) 16، TDP-43 (DNA استجابة transactive بروتين ملزمة 43) 17 أو 18 ستاوفن. على وجه الخصوص، والبروتينات مثل TIA-1 / R هي، مثل G3BP، nucleating البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي التي يمكن أن تحدث عند التجميع SGS بإفراط (overexpressed)، حتى لو كان SGS شكلت مختلفة يمكن أن تختلف في وظيفة والتنظيم والنصوص المرتبطة بها. ترنسفكأيشن من النسخة الموسومة fluorophore من أي من هذه المكونات الرئيسية أو nucleators من SGS لا يمكن أن يؤديها لصورة معينة التجمع اس جي اس والديناميات.
الخطوات الأكثر أهمية في قلق بروتوكول ترنسفكأيشن وأكثر من ذلك وخاصة عمليات الاستحواذ الفاصل الزمني، والتي يجب مراقبتها بعناية من أجل خفض أسفل السمسة.
ثقافة الخلايا الأولية ليس الجزء الصعب، طالما يتم الحفاظ على ظروف معقمة ويتم أخ…
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أنوه مونبلييه ريو التصوير (MRI) منصة حيث أجريت عمليات الاستحواذ. أنها أشكر إيزابيل كريستينا لوبيز ميخيا، الكسندرا ميتز، إيرينا Lassot، صولانج Desagher، فابيان Loustalot، وفيرجيني جورجيت لمساعدتهم في أجزاء مختلفة من البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بحوث صب لا MEDICALE (FRM) (إيكيب FRM 2011-N ° DEQ20111223745).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Pre-warm at 37 °C |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
Non essential amino acids | Gibco | 11140 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
Trypsin | Gibco | 15096 | |
Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
DMEM | Gibco | 31966 | Pre-warm at 37 °C |
HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
Neurobasal | Gibco | 21103 | Pre-warm at 37 °C |
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges) |
Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0,1 mm |
Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |