Визуализация G3BP стресс Гранулы Dynamics в живых первичных клеток
Summary
Стресс гранулы (SGS) являются цитоплазматические гранулы РНК, содержащие зашедших в тупик частицы рибонуклеопротеин (мяРНП), и важно в клеточного ответа на различных стрессов. Динамика ИК может следовать в живых клетках, визуализируя локализацию помеченной составляющей ИК в трансфектированных первичных клеток после стресса.
Abstract
SGs могут быть визуализированы в клетках иммунным окрашиванием конкретных белковых компонентов или полиА + мРНК. SGs очень динамичны и изучение их собраний и судьбы Важно понимать, клеточный ответ на стресс. Дефицит в ключевых факторов ПГ как G3BP (домен связывающий белок RasGAP SH3) приводит к дефектам развития у мышей и изменениями центральной нервной системы. Для изучения динамики ИК в клетках из организма, можно культуры первичных клеток и следуйте локализацию трансфицированной меткой компонента ПГ. Мы описываем покадровой эксперимент наблюдать G3BP1 содержащих ГХ в мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs). Этот метод также может быть использован для изучения G3BP содержащих ГХ в живых нейронов, что имеет решающее значение, как недавно было показано, что эти SGs формируются в начале нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Этот подход может быть адаптирован к любым другим компонентом клеточного тела и гранулы белка, и выполняетсяс трансгенными животными, позволяя живой исследование динамики гранул, например, в отсутствие конкретного фактора этих гранул.
Introduction
Стресс гранулы (SGS) не являются мембранные цитоплазматический очаги образуются в клеточном защитной реакции на воздействия окружающей среды, например, повышенной температуре, окислительный стресс, гипоксия, осмотического шока, УФ-облучения, лишение глюкозы или вирусной инфекции 1. Они могут быть индуцирован химически путем обработки соединений, таких как арсенита натрия, который вызывает окислительный стресс. SGs накапливаются тупик перевода арестован посыльного рибонуклеопротеин (mRNPs) комплексы 2, наложение ареста мРНК от трансляционного аппарата, и их сборка может быть вызвано фосфорилирования eIF2α (коэффициент эукариотической инициации 2 α). SGs динамические структуры, которые обмениваются компоненты с полисом и других гранул, как Р-органов. Они представляют собой «сортировки центр", где мРНК сортируются и обрабатываются либо перевода, реинициацию, деградации или упаковки в стабильных, не полисомной mRNPs 3. Сборка ПГ быстро бут это постепенный процесс с начальными многочисленных мелких агрегатов, которые сливаются в более крупные гранулы. Использование химических ингибиторов, которые нарушают или стабилизации микротрубочек показывает, что микротрубочки сети требуется для динамики SG включая монтаж, слияний и разборки процессов.
Динамическая сборка ПГ способствует также агрегации конкретных РНК-связывающих белков (РНК-ВР), как TIA-1 (Т-клеток внутреннего антиген-1) и TIAR (TIA-1, связанных белка), которые способны димеризуются и способствовать полисом разборку и маршрутизацию мРНК в ИК 4. G3BP (RasGAP SH3 домен связывающий белок) такова, РНК-ВР, что локализуется в ИК когда клетки подчеркнуть, с арсенитом или при высокой температуре, и избыточная экспрессия дефосфорилированного G3BP может индуцировать SGS узел 5.
G3BP является эволюционно консервативными РНК-ВР, который был первоначально характеризуется через его взаимодействия с белка, активирующего Рас-GTPase (RasGAP р120 6); но это взаимодействие было недавно повторно 7. Семья G3BP входят два члена у млекопитающих, G3BP1 (именуемые G3BP) и G3BP2 8. Оба белка локализуются в ИК, когда клетки подвергаются стрессу 9. G3BPs включают N-концевой домен NTF2 предложил оказывать влияние на их локализацию и олигомеризации, а затем пролина (PxxP) мотивы, то С-концевые мотивы, связанные с связывания РНК: каноническое РНК-Recognition Motif (RRM) с консервативных RNP1 и RNP2 мотивов , с последующим богатой (РГГ) окне аргинин-глицин. Интересно, что анализ различных частях белка путем построения разные домены, слитые с EGFP показали, что NTF2-подобного домена и РНК-связывающий домен были наиболее эффективно нанят для ПГ, предполагая важность свойств димеризации и связывания РНК в сборка ПГ. Разнообразные модели выявили различные функции G3BP белков в пробирке 10-13.Срыв G3BP в мышах показали важность этого белка в росте развития и выживания 14, а также важную роль для G3BP в центральной нервной системы (ЦНС), характеризуется атаксией и дефектов в пространственной рабочей памяти 15. Дефицит G3BP приводит к измененной нейронов пластичности и кальция гомеостаза, устанавливая прямую связь между формированием SG и нейродегенеративных заболеваний 15. Таким образом, важно, чтобы иметь возможность изучить динамику ПГ в первичных клеток, как нейроны.
Этот протокол обеспечивает простой способ наблюдать сборку G3BP1 содержащих ИК в первичных клеток на лечении арсенит. Он может быть использован для изучения SGS сборки при различных условиях, например, различные виды нагрузок. Он также может быть приспособлен к другим гранул или других компонентов ПГ. В самом деле, этот протокол фокусируется на G3BP1, но есть и другие гранулы стресс маркеры, как TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (ломкой Х Умственная отсталость Синдром белок) 16, TDP-43 (ответ транзактивной ДНК-связывающего белка 43) 17 или Staufen 18. В частности, белки, такие как TIA-1 / R, подобно G3BP, зародышеобразования РНК связывающих белков, которые могут вызвать SGS сборку при избыточной экспрессии, даже если различные образованные SGs может отличаться в зависимости, регулирования и связанных с ними транскриптов. Трансфекция флуорофора с метками версии любой из этих ключевых компонентов или нуклеаторов из ИК могут быть выполнены, чтобы изображения конкретной сборки и динамики SGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги в протоколе озабоченностью трансфекции и более конкретно приобретений промежуток времени, которые должны быть тщательно проверены, чтобы снизить вниз цитотоксичность.
Культура первичных элементов не является трудной частью, пока стерильные усло?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность за Монпелье Рио томография (МРТ) платформу, где были проведены приобретения. Они благодарят Isabel Cristina Lopez Mejia, Александра Мец, Ирина Lassot, Соланж Desagher, Фабьен Loustalot и Виржини Жорже за помощь в разных частях протокола. Эта работа была поддержана Fondation Pour La Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-п ° DEQ20111223745).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Pre-warm at 37 °C |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Non essential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Pre-warm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Pre-warm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0,1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
Referências
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
- Tourrière, H., et al. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).
- Parker, F., et al. A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).
- Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1. PLOS ONE. 6 (12), (2011).
- Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies. Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).
- Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress. PLOS ONE. 7 (4), (2012).
- Tourrière, H., et al. RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).
- Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway. Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).
- Solomon, S., et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).
- Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease. Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).
- Zekri, L., et al. Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP. Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).
- Martin, S., et al. Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons. Journal of neurochemistry. , (2013).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Colombrita, C., et al. TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult. Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).
- Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly. Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).
- Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Current protocols in neuroscience. 3, (2001).
- Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation. Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).
- Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).
