Grânulos de estresse (SGs) são grânulos de RNA citoplasmático contendo partículas paralisadas ribonucleoproteínas (RNPs), e importante na resposta celular a várias tensões. Dinâmica da SGS pode ser seguido em células vivas, visualizando a localização de um componente marcado da SGS em células primárias transfectadas após o estresse.
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Artigo de método
Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A SGS pode ser visualizada nas células por imunocoloração de componentes protéicos específicos ou poli + mRNAs. SG são altamente dinâmico e o estudo da sua montagem e o destino é importante entender a resposta celular ao stress. A deficiência em fatores-chave da SGS como G3BP (RasGAP SH3 domínio Binding Protein) leva a defeitos de desenvolvimento em ratos e alterações do Sistema Nervoso Central. Para estudar a dinâmica da SGS em células de um organismo, pode-se pilhas de cultura e seguir a localização de um componente marcado transfectadas da SGS. Descrevemos experiência de lapso de tempo para observar contendo G3BP1 SGS em rato embrionárias fibroblastos (MEFs). Esta técnica também pode ser usada para estudar SGs contendo G3BP em neurónios vivos, o que é fundamental, uma vez que foi demonstrado recentemente que estes SG são formadas no aparecimento de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Esta abordagem pode ser adaptada a qualquer outro componente do corpo celular e de proteína de grânulo, e realizadacom animais transgénicos, que permite o estudo directo de grânulos, por exemplo, a dinâmica na ausência de um factor específico destes grânulos.
Introdução
Grânulos de estresse (SGs) são focos citoplasmática não-membranoso formado como uma resposta protetora celular ao estresse ambiental, tais como temperatura elevada, estresse oxidativo, hipóxia, choque osmótico, a irradiação UV, a privação de glicose, ou infecção viral 1. Eles podem ser quimicamente induzida por tratamento com compostos como o arsenito de sódio, o que desencadeia o stress oxidativo. SG acumular tradução preso parado mensageiro ribonucleoprotein (mRNPs) complexos 2, sequestrando mRNAs da maquinaria de tradução, e sua montagem pode ser desencadeada pela fosforilação de eIF2α (fator de iniciação eucariótico 2 α). SG são estruturas d....
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Protocolo
Todos os procedimentos com animais neste protocolo estão em estrita observância com as diretrizes da Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia, de 24 de Novembro de 1986 (86-609/EEC). Casa dos ratos no grupo, permitindo que alimentos e água ad libitum. Mantê-los em um ambiente controlado (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% de umidade), com uma hr 12: 12 luz hr: ciclo escuro (luz às 7:00 am).
1 Cultura de Células Murino preliminares:. Rato embrionárias fibroblastos (MEFs)
- Autoclave fórceps finos, bem como uma pinça curvos e as tesouras de dissecção. Guarde em um recipiente estéril. Use estéril D-PBS (Phosphate-Buffered Saline Dulbec....
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Resultados
A formação de grânulos de stress é importante na resposta de células ao stress, permitindo uma adaptação celular com tradução parada, até que a pressão foi eliminada, associado à prevenção de apoptose. Este ensaio permite estudar as SGS em células primárias, seguindo a localização dos principais componentes proteicos SGs (Figura 1). G3BP, um fator-chave de montagem SG, está presente, em vez difusamente no citoplasma das MEFs cultivadas ou neurônios (Figura 2A A e C), e .......
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Discussão
Os passos mais críticos no protocolo preocupação a transfecção e mais particularmente as aquisições lapso de tempo, que devem ser cuidadosamente monitoradas a fim de baixar a citotoxicidade.
Cultura de células primárias não é uma parte difícil, desde que sejam mantidas condições estéreis e cuidado é tomado para evitar danos durante as etapas de dissecação e de dissociação celular. MEFs pode ser mantido congelado no início passagens. Neuron transfecção com fosfato de cálcio tem sido demonstra.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a plataforma Montpellier Rio (RM) onde foram realizadas as aquisições. Eles agradecem Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot, e Virginie Georget por sua ajuda em diferentes partes do protocolo. Este trabalho foi apoiado pela Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM / F12 | Gibco | 21331 | Pré-aquecer a 37 ° C |
| Piruvato de sódio | Gibco | 11360 | |
| Aminoácidos não essenciais | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030 | |
| Tripsina | Gibco | 15096 | |
| Fundo de vidro B-35 | Greiner | 627860/627861 | Tratado ou não (tratado: aumenta a fixação das células aderentes) |
| Poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Pré-aquecimento a 37 ° C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Gibco Neurobasal | 21103 | Pré-aquecido a 37 ° C | |
| 2-mercaptoetanol | Gibco | 31350 | |
| Fórceps | Biotek | DU-110-A | Muito fino, pontas 0,1 mm (útil para remover meninges) |
| Pinça curva | Biotek | P-110-BUF | Muito fino, pontas 0,1 mm |
| Tesoura pequena | Biotek | CM-85-BS | Pode ser útil para remover hipocampos |
| Transfecção Polyplus Reagente JetPEI | Ozyme | 101-10 | MEFs transfecção, siga o protocolo de encaminhamento |
| Microscópio confocal de varredura a laser invertido | Leica | SP5 |
Referências
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and trans....
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Reimpressões e permissões
