Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

Resumo

Este trabalho descreve um novo método para alvejar seletivamente organelas subcelulares nas plantas, analisadas usando o BioRad Gene Gun.

Resumo

A fim de orientar uma única proteína para várias organelas subcelulares, plantas tipicamente duplicar os genes relevantes e expressar cada gene separadamente usando estratégias regulatórias complexas, incluindo promotores diferenciais e / ou seqüências de sinais. Engenheiros metabólicas e biólogos sintéticos interessadas no direccionamento enzimas para um organelo particular, são confrontados com um desafio: Para que uma proteína que é para ser localizada a mais de um organelo, o engenheiro necessário clonar o mesmo gene várias vezes. Este trabalho apresenta uma solução para esta estratégia: o aproveitamento splicing alternativo do mRNA. Esta tecnologia aproveita de cloroplasto estabelecida e seqüências peroxissoma segmentação e as combina em um único mRNA que é alternativamente emendados. Algumas variantes de processamento são enviados para o cloroplasto, algum do peroxissoma, e outros para o citosol. Aqui o sistema é projetado para múltiplo organela alvo com splicing alternativo. Neste trabalho, a GFP era esperado para ser exprEssed no cloroplasto, citosol, peroxissoma e por uma série de racionalmente concebidos 5 'tags de mRNA. Estas etiquetas têm o potencial de reduzir a quantidade de clonagem necessária quando os genes heterólogos têm de ser expressos em vários organelos subcelulares. As construções foram concebidas em trabalho anterior ^11, e foram clonados utilizando a montagem de Gibson, um método de clonagem independente de ligação que não necessita de enzimas de restrição. Os plasmídeos resultantes foram introduzidos na Nicotiana benthamiana células da epiderme da folha, com um protocolo modificado do gene da arma. Finalmente, as folhas transformadas foram observadas por microscopia confocal.

Introdução

Este trabalho é um projeto de engenharia biologia / sintético metabólica em que as células de plantas são projetados para expressar uma proteína repórter em várias organelas, mas com apenas uma única construção de DNA.

Uma abordagem para proteínas alvo de mais do que um local envolve múltiplas cópias genéticas de clonagem, contendo cada um péptido localização diferente. Cada cópia deve ser introduzido por sucessivas retransformação ou, alternativamente, por retrocruzamentos transforms solteiro ^1. Isto envolve a clonagem adicional, e é limitada por uma etiqueta de localização por terminal.

Outra mane....

Protocolo

1. Projeto de Seqüências Alternativamente-emendados para vários Organelle Segmentação

1. Determinar os locais de expressão de proteína final. Para este trabalho, o interesse é na segmentação do cloroplasto, peroxissomo e citosol.
2. Use a literatura para identificar seqüências de proteínas e de DNA conhecidos como alvo proteínas para organelas de interesse. Neste caso, uma sequência de direccionamento a partir de cloroplastos de Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferase ^6,15, e uma sequência de direccionamento de peroxissoma de Arabidopsis thaliana, como a transtirretina-S-alantoína sintase ^....

Resultados

O esforço do projeto foi o resultado de um planejamento significativo. Novel para este projecto é a utilização de processamento alternativo para criar uma pré-ARNm que é traduzido em proteínas diferencialmente expressas. Estas proteínas são expressas em diferentes organelos, neste caso, o cloroplasto, peroxisoma e / ou citoplasma. Foram adaptados gene Arabidopsis natural que é alternativamente emendados ^6, e colocadas conhecido cloroplasto ⁶ e ¹⁷ sequências de direccionamento de.......

Discussão

Neste estudo, as estratégias simples são descritos para a localização de uma única proteína transgénica para vários compartimentos celulares em plantas. O objetivo era projetar construção que expressasse um único gene em mais de uma organela em Nicotiana benthamiana. As estratégias incluem desenho racional de construções de DNA baseado em GFP, montagem Gibson, a entrega dos plasmídeos de células da folha com o Gene Gun, e observação dos resultados com a microscopia confocal.

Três, t.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Oligonucleotídeos primers	IDT	(personalizado)	Design especificamente para construir
GeneBlocks	IDT	(personalizado)	500 bp oligonucleotídeos
ApE software	U Utah	(download)	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit	Qiagen	28004	Usado para purificar produtos de PCR
QIAprep spin miniprep kit	Qiagen	27104	Usado para preparar quantidades apropriadas de clonagem de plasmídeo
Phusion Master Mix com GC Buffer	NEB	M0532S	Usado para amplificar por PCR o gene de interesse Mistura de reação de
montagem Gibson	NEB	E2611L	Master mix dos seguintes 9 ingredientes
1 M Tris-HCl pH7.5	Teknova	T1075	Mistura de montagem Gibson
1 M MgCl2	G Biosiences	82023-086 Mistura de	montagem
Gibson mistura dNTP Fermentas		R0192	Mistura de montagem Gibson
1 M DTT	Fermentas	R0861	Mistura de montagem
Gibson PEG-8000	Affymetrix	19966	Mistura de montagem Gibson
NAD	Applichem	A1124,0005	Mistura de montagem
Gibson T5 exonuclease	Epicentro	T5E4111K	Mistura de montagem Gibson
Phusion polimerase	NEB	F530S	Gibson assembly mix
Taq DNA ligase	NEB	M0208L	Gibson assembly mix
Gibthon.org			Website para simplificar cálculos
Plasmid PLUS Maxi kit	Qiagen	12963	Usado para preparar DNA para balas de armas genéticas
Sistema Gene Gun	BioRad	165-2451	Inclui todas as peças necessárias
Nicotania benthamiana	(n/a)	(n/a)	Presente de Jen Sheen, MGH
Microscópio confocal	Leica	SP5 X MP	Imagem de células resultantes Lâminas de
poço	profundo Microscopia eletrônica Ciências	71561-01	Usado para imagens confocais
Um Editor de Plasmídeo (ApE)	Universidade de Utah		http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Calculadora			de

ligadura http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/