Переходные экспрессии генов в табак с помощью Gibson Ассамблею и генной пушки
Summary
Эта работа описывает новый способ селективного ориентации субклеточных органелл в растениях, анализировали с использованием BioRad Gene Gun.
Abstract
В целях выявления один белок нескольким субклеточных органелл, растения, как правило, дублируют соответствующие гены, и выразить каждый ген по отдельности, используя сложные стратегий в области регулирования, включая дифференциальных промоутеров и / или сигнальные последовательности. Метаболические инженеры и синтетические биологи, заинтересованные в ориентации ферменты для конкретной органеллы столкнулись с проблемой: белок, который должен быть локализован в более чем одной органеллы, инженер должен клонировать и того же гена многократно. Эта работа представляет собой решение этой стратегии: освоение альтернативного сплайсинга мРНК. Эта технология использует преимущества установленном хлоропластов и пероксисомы ориентации последовательностей и объединяет их в единую мРНК, которая альтернативного сплайсинга. Некоторые варианты сплайсинга отправляются в хлоропласт, некоторые к пероксисоме, а некоторые в цитозоль. Здесь система предназначена для многократного органелл ориентации с альтернативного сплайсинга. В этой работе, GFP как ожидается, будет выражениеEssed в хлоропластов, цитозоле и пероксисоме по серии рационально спроектированными 5 'мРНК тегов. Эти теги имеют потенциал, чтобы уменьшить количество клонирования требуется при гетерологические гены должны быть выражены в нескольких внутриклеточных органелл. Конструкции были разработаны в предыдущей работе 11, и были клонированы с использованием Gibson собрание, перевязки независимый метод клонирования, который не требует ферменты рестрикции. Полученные плазмиды вводили в Nicotiana benthamiana эпидермальный клетках листа с измененным протоколом генной пушки. Наконец, преобразованные листья наблюдались с конфокальной микроскопии.
Introduction
Эта работа является метаболической инженерии / синтетическая биология проект, в котором растительные клетки, сконструированные для экспрессии репортера белка в нескольких органелл, но только с одной конструкции ДНК.
Один из подходов к белков-мишеней в более чем одном месте включает клонирование несколько генетических копий, каждая из которых содержит различной локализации пептида. Каждая копия должна быть введена путем последовательного retransformation, или, наоборот, обратным скрещиванием одинокий преобразований 1. Это включает в себя дополнительную клонирование, и ограничивается одной метке локализации на конце.
Еще один способ локализовать белок в нескольких местах через альтернативного сплайсинга 2-5. РНК транскрибируется из одного гена, но разные копии транскрипта обрабатываются по-разному, часто в более чем одним способом на ячейку. Это может привести к более чем одной РНК в клетке транскрибируется из одного гена. Такие разные MessengeR может кодировать РНК для различных изоформ одного и того же белка, или в случае сдвигу рамки, другим белком в целом. Хотя альтернативный сплайсинг был описан в литературе в течение многих лет, механизмы действия и консервативной донора и рецепторных сайтов сплайсинга только быть выяснены в последнее время 6. Как эти сайты в настоящее время лучше описать, они открывают возможности для машиностроения.
Инженеры метаболические завод столкнулись с проблемой при выражении белок в нескольких органелл. Для белка, который должен быть локализован в более чем одной органеллы, инженер должен клонировать и того же гена многократно, каждый с отдельным сигнальной последовательности направляя ее на органеллы интерес. Для одного гена в трех органелл, это просто три гена. Но в течение шести генов метаболизма, это расширяет до 18 генов, значительных усилий клонирования. Объединение нескольких последовательностей локализации в единый, альтернативно-сплайсированному знакificantly уменьшает эти усилия. Например, реинжиниринг фотодыхание 7,8 и изопреноид синтез 9,10 включает в себя как хлоропластов и пероксисомах. В нашем случае мы воспользовались сайтов сплайсинга как это наблюдается в естественной Arabidopsis системы THALIANA описано ранее 6. Мы рационально переработан последовательность мРНК оставив естественное сайтов сплайсинга в одиночку, но размещены последовательности, которые бы кодируют хлоропласты-или пероксисомы таргетирования теги течение альтернативно-сращены интронов (рис. 1). Экспрессированный белок может иметь или не иметь метку, в зависимости от того, был вырезан пре-мРНК, которая кодируется как интрона (данные 1g и 1h). Более подробную информацию о проектировании конструкций, представленных в этой работе, см. в статье спутником 11.
Потому что это все еще значительные усилия клонирование, Гибсон монтаж, новый метод клонирования ДНК конструкты, является исед в строительстве. Способ Gibson могут быть использованы для любой последовательности, независимо от сайтов рестрикции (рис. 2) 12-14. Удельный смесь ферментов позволяет за один шаг, изотермический сборки в. В этом способе, несколько двухцепочечные линейные части ДНК выполнены так, что они имеют перекрывающиеся последовательности ~ 50 б. Гибсон сборка Смесь ферментов частично переваривает линейные части ДНК, подвергая одиночные нити гомологичных последовательностей. Эти частичные одноцепочечные последовательности повторно отжигали в реакционной смеси, что привело к быстрому, одноступенчатый, независимый от последовательности, лигирование, свободной от реакции субклонирования.
Эта работа описывает 1) рациональную конструкцию альтернативного сплайсинга конструкции для выражения в хлоропластах растений, пероксисомах и cytosols, 2) их клонирование с помощью нового перевязки без метод Gibson сборки, 3) их доставка в табачного листа клеток с генной пушки, и 4) результаты, показывающие органелл адресности, как это наблюдается с GFPи конфокальной микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании, простые стратегии описаны для локализации одну трансгенную белка в несколько клеточных компартментах в растениях. Цель заключается в разработке конструкции, которая бы выразить один ген в более чем одной органеллы в Nicotiana benthamiana. Стратегии включают рациональ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Джен Шин из Массачусетского общего госпиталя за щедрое пожертвование Nicotiana benthamiana саженцев. Джен Буш помог нам значительно в консультации в выращивании растений и создание растильню область. Том Ферранте из Висс институт предложил важную помощь с конфокальной микроскопии. Авторы особенно хотел бы поблагодарить Дона Ingber Детской больнице Бостона и Висс институт по щедрому пожертвованию генной пушки и связанных поставок. Финансирование этого проекта была оказана в рамках соглашения о сотрудничестве с Департаментом энергетики Агентства перспективных исследовательских проектов (ARPA-E Award # DE-000079) для PAS, JCW, и МДМ, и через Chimerion биотехнологии, Inc для MJV.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
Referências
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants – coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5′- and 3′-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5′ mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
