Imagerie à travers le cas de la nymphe<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Ce document illustre l'utilisation d'un balayage rapide microscope confocal à un comportement cellulaire de l'image directement à travers la pupe. En laissant la coque de nymphose intacte, cette méthode permet l'observation et la mesure des processus dynamiques de cellule à un stade de développement de la drosophile qui est difficile à étudier directement.
Abstract
L'utilisation de longue date de la drosophile comme modèle pour la biologie cellulaire et de développement a donné une gamme d'outils. Ensemble, ces techniques ont permis l'analyse de cellules et de la biologie du développement à partir d'une variété d'angles méthodologiques. Imagerie en temps réel est une nouvelle méthode pour l'observation des processus dynamiques de cellule, telles que la division cellulaire ou de la motilité cellulaire. Après avoir isolé des mutations dans les protéines du cycle cellulaire putatifs non caractérisés, il est devenu essentiel d'observer la mitose in situ en utilisant l'imagerie en direct. La plupart des études d'imagerie en direct chez la drosophile ont porté sur les stades embryonnaires qui sont accessibles à la manipulation et l'observation en raison de leur petite taille et de clarté optique. Toutefois, dans ces phases du cycle cellulaire est inhabituel en ce qu'il manque une ou deux des phases de l'écart. En revanche, les cellules de l'aile des pupes de la drosophile ont un cycle cellulaire typique et subissent une période de mitose rapide couvrant environ 20 h de développement des pupes. Il est facile d'identify et isoler les nymphes de la scène appropriée pour attraper la mitose in situ. Montage pupes intact offrait la meilleure combinaison de traçabilité et de durabilité lors de l'imagerie, permettant des expériences de courir pendant plusieurs heures avec un impact minimal sur la cellule animale et la viabilité. La méthode permet l'observation de caractéristiques aussi petites ou plus petites que, voler chromosomes. Ajustement des réglages du microscope et les détails de montage, a permis l'extension de la préparation de visualiser la dynamique des membranes des cellules adjacentes et les protéines marquées par fluorescence tels que la tubuline. Cette méthode fonctionne pour toutes les protéines fluorescentes testé et peut capturer submicroniques caractéristiques d'échelle sur une variété d'échelles de temps. Bien que limitée à l'extérieur de 20 um de la nymphe avec un microscope confocal classique, cette approche à l'observation de protéines et dynamique cellulaires dans les tissus des pupes in vivo peut être généralement utile dans l'étude de la biologie cellulaire et de développement dans ces tissus.
Introduction
La mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster, est un modèle bien établi pour étudier de nombreux aspects de la biologie. Recherche Drosophila a une riche histoire de l'expérimentation génétique qui permet des formes plus sophistiquées de manipulation de gènes dont l'expression, démontable et mutation. Avec l'avènement des étiquettes de protéines fluorescentes, ce répertoire a été élargi pour inclure des études sur des cellules et des protéines chez les animaux vivants. L'embryon de mouche est un excellent système pour les études qu'elle est petite et optiquement clair permettant profonde, haute résolution imagerie in vivo 1-3. D'autres étapes du développement de la mouche se sont avérées moins docile, nécessitant anesthésie 4, la dissection et de la culture à court terme de 5,6, ou la création de fenêtres de la cuticule pour l'imagerie 7,8. Ces manipulations compromettent généralement le développement animal à long terme ou affectent l'animal de manière à limiter l'imagerie pour de courtes périodes.
ent "> Pour étudier de nouvelles mutations dans les gènes qui ressemblent à des régulateurs du cycle cellulaire, il est essentiel de trouver une préparation appropriée pour étudier le calendrier et la fidélité du cycle cellulaire. Comme la plupart des cycles de cellules embryonnaires sont tronqués (SM ou S-G2-M) et les mutants étudiés ne présentent pas de défauts jusqu'à ce que les étapes ultérieures, il est important d'observer le cycle cellulaire dans les tissus stade de pupe. cellules épithéliales de la pupe ont un cycle cellulaire G1-S-G2-M plus typiques et les nymphes de cette étape sont pas capable de mouvements musculaires 9. Le point de départ initial pour les manipulations inclus toute pupes intact exprimer Histone2AV-GFP. Malgré l'apparente opacité de la pupe, cette préparation intacte s'est avérée excellente à long terme dans l'imagerie in vivo. Cette technique est simple assez que les chercheurs de premier cycle utilisent régulièrement pour étudier les aspects de la biologie cellulaire et de développement chez la drosophile et pourtant la résolution est assez fine pour permettre la discrimination des fonctionnalités à l'échelle du micromètre. Avec cette méthode, l'observation des événements au cours des heures, minutes ou secondes sont possibles simplement en ajustant les paramètres de séries chronologiques. Vidéos en utilisant bleu, des protéines fluorescentes vertes, jaunes, oranges, rouges et, ou des combinaisons de ceux-ci, ont été réalisés. Surtout, si les soins sont prises pour minimiser l'intensité du laser, même imagerie à long terme n'a pas d'effet sur le développement ou la viabilité des animaux.Protocol
Representative Results
Discussion
Pour visualiser, mesurer et quantifier les caractéristiques des cellules en division, le développement nécessaire d'une préparation simple pour l'observation de la mitose dans l'aile pupe vie de la drosophile par des moyens d'analyse confocale de cellules exprimant His2AvGFP. Cette méthode a été utilisée pour documenter que le cycle cellulaire dans l'aile pupe porte de fortes similitudes avec la cellule cycles dans l'épithélium pseudo-stratifié en ce que les noyaux passage à …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Akira Chiba pour un soutien intellectuel, le soutien matériel et les stocks. Merci à Julia Dallman pour commentaires.
Materials
| Fly stuff fly pad | Genesee scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas south | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas south | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine science tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular and subcellular features | |
| Immersion oil (non fluorescent) | |||
| Stereo microscope | any | For fly manipulation |
Referências
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