의 번데기 케이스를 통해서 영상<em> 초파리</em
Summary
이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.
Abstract
세포 및 발달 생물학 모델로 초파리의 오랜 사용 도구의 배열을 굴복했다. 함께, 이러한 기술은 방법 론적 다양한 각도에서 세포 및 발달 생물학의 분석을 사용할 수있다. 라이브 영상은 세포 분열 또는 세포 운동성 동적 셀 프로세스를 관찰하기위한 새로운 방법이다. 그것은 실시간 이미징을 사용하여 반응계 내에서 유사 분열을 관찰하는 것이 필수적이되었다에 uncharacterized 추정 세포주기 단백질에 돌연변이를 갖는 격리. 초파리에있는 대부분의 라이브 영상 연구 때문에 그들의 작은 크기와 광학 선명도의 조작과 관찰에 액세스 할 수있는 배아 단계에 초점을 맞추고있다. 이 간극 단계 중 하나 또는 모두를 결여에 그러나, 이들 단계에서 세포주기가 드물다. 대조적으로, 초파리의 번데기 날개의 세포는 전형적인 세포주기를 가지고 번데기 전개 약 20 시간에 걸쳐 급격한 유사 분열주기를 겪는다. 내가 용이dentify 및 현장에서 유사 분열을 잡을 수있는 적절한 단계의 번데기를 분리. 설치 그대로 번데기 실험은 세포와 동물 생존에 미치는 영향을 최소화하면서 몇 시간 동안 실행할 수 있도록 이미징 동안 취급 용이성 및 내구성의 최상의 조합을 제공했다. 이 방법은 작은, 또는보다 작은 염색체를 비행 기능을 관찰 할 수 있습니다. 현미경 설정 및 설치의 세부 사항 조정, 준비의 확장을 막 인접 셀의 역학과 같은 튜 불린과 같은 형광 표지 단백질을 시각화 할 수있었습니다. 이 방법은 모든 시험 형광 단백질을 작동 시간 규모의 다양한 통해 서브 마이크론 규모의 기능을 캡처 할 수 있습니다. 기존의 공 초점 현미경으로 번데기의 외부 20 μm의 제한하지만, 생체 내에서 번데기 조직에서 단백질과 세포 역학을 관찰하는이 방법은 이러한 조직에서 세포 및 발달 생물학의 연구에서 일반적으로 유용 할 수 있습니다.
Introduction
식초 파리, 초파리 melanogaster의는. 초파리 연구를 표현, 최저 돌연변이 등의 유전자 조작의 세련된 형태를 허용 유전자 실험의 풍부한 역사를 가지고 생물학의 여러 측면을 연구하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다. 형광 단백질 라벨의 도래와 함께,이 레퍼토리는 살아있는 동물의 세포와 단백질의 연구를 포함하도록 확장했다. 플라이 배아는 생체 내 1-3 깊은, 고해상도 영상을 허용 작은 광학적으로 알 수있는 바와 같이 이러한 연구를위한 훌륭한 시스템이다. 플라이 개발의 다른 단계 진통제 4, 해부 및 단기 문화 5,6, 또는 영상 7,8의 표피에있는 윈도우의 생성을 필요로하는, 덜 다루기 쉬운적일 수있다. 이러한 조작은 보통 장기 동물 발달을 손상 또는 짧은 기간에 촬상을 제한 방식으로 동물에 영향을 미친다.
대부분의 배아 줄기 세포주기가 절단되기 때문에 세포주기 규제 유사 유전자의 새로운 변이를 연구하는 엔트 ">, 그것은. 세포주기의 타이밍과 충실도를 연구하는 적절한 준비를 찾을 수 필수적이었다 (SM 또는 S-G2-M) 및 연구에서 돌연변이는 이후 단계까지, 그것은 번데기 조직에서 세포주기를 관찰하는 것이 중요하다고 결함을 표시하지 않습니다. 번데기에있는 상피 세포가 전형적인 G1-S-G2-M 세포주기와이 단계의 번데기가이 근육의 움직임 9 할 수 없다. 조작에 대한 초기 시작 지점 번데기 경우의 명백한 불투명도에도 불구하고 Histone2AV-GFP를 표현 그대로 전체 번데기를. 포함이 그대로 준비가 생체 내 이미징에서 장기적으로 우수한 것으로 판명.이 기술은 간단합니다 학부 연구원이 정기적으로 초파리에서 세포 및 발달 생물학의 측면을 연구하는 데 사용할 아직 해상도가 마이크로 미터 스케일 기능의 차별을 할 수 있도록 충분히 괜찮 충분히. 이 방법에서는, 시간, 분, 또는 초 이상의 이벤트의 관측은 단순히 시계열 파라미터를 조정함으로써 가능하다. 파란색, 녹색, 노란색, 오렌지색과 적색 형광 단백질, 또는 이들의 조합을 사용하여 비디오,되었습니다. 중요한 경우, 치료조차 장기간 이미징 동물의 개발이나 생존에 영향이 없으며 레이저의 강도를 최소화하도록 수행된다.Protocol
Representative Results
Discussion
분할 세포의 기능, His2AvGFP 발현 세포의 공 촛점 분석을 통해 초파리의 살아있는 번데기 날개의 유사 분열을 관찰하기위한 간단한 준비에 필요한 개발을 시각화, 측정, 정량화한다. 이 방법은 번데기 날개의 세포주기가 유사 분열을 입력 상피 세포의 꼭대기의 표면에 그 핵의 움직임에 pseudostratified 상피 세포의주기를 셀에 강한 유사성을 맺는 것을 문서화하는 데 사용되었다. telophase에 따라…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 지적 지원, 물자 지원, 종목 아키라 치바을 인정하고 싶습니다. 덧글에 대한 줄리아 달만에 감사합니다.
Materials
| Fly stuff fly pad | Genesee scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas south | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas south | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine science tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular and subcellular features | |
| Immersion oil (non fluorescent) | |||
| Stereo microscope | any | For fly manipulation |
Referências
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