Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes
Summary
Wir präsentieren eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie, Lipid Nanotechnologie und Strukturanalyse angewandt, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen: Mensch und Schwein. Die in unserem Labor entwickelt, um spiralförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT)-Methode beschrieben.
Abstract
Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) 1 ist ein leistungsfähiges Konzept für die funktionale Struktur von Proteinen und Komplexen in einem hydratisierten Zustand und 2 Membranumgebung zu untersuchen.
Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) 3 ist ein Multi-Domain-Blutplasma-Glykoprotein. Defekt oder Mangel an FVIII ist die Ursache für Hämophilie Typ A – eine schwere Blutgerinnungsstörung. Nach der proteolytischen Aktivierung bindet FVIII an den Serin-Protease Faktor IXa auf der negativ geladenen Plättchenmembran, die entscheidend für die normale Blutgerinnung 4 ist. Trotz der zentralen Rolle spielt in FVIII-Koagulation, Strukturinformationen für die Membran-gebundenen Zustand ist unvollständig 5. Rekombinanten FVIII-Konzentrat ist das wirksamste Medikament gegen Hämophilie Typ A und im Handel erhältlichen FVIII als menschliche oder Schweine, beide bildende funktionelle Komplexe mit menschlichem Faktor IXa 6,7 ausgedrückt.
"> In dieser Studie stellen wir eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), angewandte Nanotechnologie Lipid-und Strukturanalyse, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen:. Mensch und Schwein Die in unserem Labor entwickelte Methodik schraubenförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT) beschrieben. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass unser Ansatz ist empfindlich genug, um die Unterschiede in der Schrauben Organisation zwischen den beiden hoch homolog in Folge (86% Sequenzidentität zu definieren )-Proteine. Detaillierte Protokolle für die Schrauben Organisation Kryo-EM und Elektronentomographie (ET) Datenerfassung werden. Die zweidimensionale (2D angegeben) und dreidimensionale (3D) Struktur-Analyse angewendet, um die 3D-Rekonstruktionen von Mensch und Schwein erhalten FVIII-LNT wird diskutiert. Die vorgestellten Mensch und Schwein FVIII-LNT Strukturen zeigen das Potenzial der vorgeschlagenen Methodik zur kalkulierte die funktionale, membrangebundene Organisation von Blutgerinnungsfaktor VIII bei hoher Auflösung.Introduction
Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) ist ein großes Glykoprotein von 2.332 Aminosäuren in sechs Bereiche unterteilt: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Thrombin nach Aktivierung FVIII wirkt als Cofaktor, Faktor IXa in der Membran-gebundenen Tenasekomplex. Die Bindung von FVIII aktiviert (FVIIIa) zu FIXa in einer Membran-je nach Art und Weise verbessert FIXa proteolytischen Effizienz von mehr als 10 5-fache, die entscheidend für die effiziente Blutgerinnung 4 ist. Trotz der wichtigen Rolle FVIII spielt bei der Koagulation und der Tenasekomplexes Bildung, noch die funktionelle Membran-gebundenen FVIII-Struktur gelöst werden.
Um dies zu beheben, haben einzelne Lipid-Doppelschicht-Nanoröhren (LNT) reich an Phosphatidylserin (PS), die zur Bindung FVIII mit hoher Affinität 8, 9 und die aktivierte Thrombozytenoberfläche ähnlich entwickelt worden 10. Aufeinanderfolgende spiralförmigen Organisation von FVIII zu LNT gebunden ist erwiesen, wirkungs zu seinve für die Strukturbestimmung von FVIII-Membran-gebundenen Zustand von Cryo-EM-5. Funktionalisierten LNT sind ein ideales System, um Protein-Protein-und Protein-Membran-Wechselwirkungen von spiralförmig organisierten Membran-assoziierten Proteinen, die durch Kryo-EM 11, 12 zu untersuchen. Kryo-EM hat den Vorteil gegenüber herkömmlichen Konstruktionsverfahren, wie Röntgenkristallographie und NMR, als die Probe in der Nähe des physiologischen Umgebung (Puffer, Membran-pH-Wert) erhalten, ohne Additive und Isotope. Im Fall von FVIII, die Untersuchung der Membran-gebundenen Struktur mit dieser Technik ist noch physiologisch relevant, da die LNT ähneln eng durch Größe, Form und Zusammensetzung der Pseudopodien der aktivierten Thrombozyten, wo die Komplexe Tenase Zusammenbau in vivo.
Mängel und Mangel an FVIII Ursache Hämophilie A, einer Erkrankung, die schwere Blutungen 1 in 5.000 Männern der menschlichen Bevölkerung 4, 6. Die meisten Eirksame Therapie für Hämophilie A ist lebenslange Verabreichung von rekombinantem humanem FVIII (hFVIII). Eine signifikante Komplikation des rekombinanten FVIII-Hämophilie-A-Therapie ist die Entwicklung von inhibitorischen Antikörpern gegen den menschlichen Form, die bei etwa 30% der Patienten mit Hämophilie A 13. In diesem Fall wird Schweine-FVIII (pFVIII) Konzentrat verwendet, wie Schweine-FVIII-Displays geringe Kreuzreaktivität mit inhibitorische Antikörper gegen menschliches FVIII und Formen funktionalen Komplexen mit menschlichen FIXa 7. Gründung der membrangebundene Organisation von sowohl Schweine-und Menschen FVIII Formen ist wichtig, die strukturelle Basis von FVIII-Cofaktor-Funktion und Auswirkungen auf Blut Blutstillung zu verstehen.
In dieser Studie beschreiben wir eine Kombination von Lipid Nanotechnologie, Cryo-EM-und Strukturanalyse entwickelt, um die membrangebundene Organisation von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen. Die vorgestellten Cryo-EM-Daten und 3D-Strukturen für spiralförmig organisiert porcine und Menschen FVIII auf negativ geladenen LNT zeigen das Potenzial der vorgeschlagenen Nanotechnologie als Grundlage für die Strukturbestimmung von FVIII und Membran-gebundenen Gerinnungsfaktoren und Komplexe in einer physiologischen Membranumgebung.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, um zwischen zwei Membrangebundene von hochhomologen Proteinen unterscheiden: Human-und Schweine-FVIII selbstorganisierten auf den Lipidstoffnanoröhren in die Bedingungen im menschlichen Körper auftreten.
Bei dem beschriebenen Verfahren, Mensch und Schwein FVIII erfolgreich schraubenförmig auf Lipid-Nanoröhren organisiert, was der wichtigste Schritt ist. Der nächste kritische Schritt ist, um die Probe in dünnen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
10SDG3500034 und UTMB-NZB-Start-up-Fonds zu SSM: Diese Arbeit wird durch einen Nationalen Entwicklungs Scientist Zuschuss von der American Heart Association unterstützt. Die Autoren erkennen die Cryo-EM und Wissenschaftliches Rechnen Einrichtungen des Sealy Zentrum für Strukturbiologie am UTMB ( www.scsb.utmb.edu ) sowie Drs. Steve Lüdtke und Ed Egelman Hilfe zu den 2D-und 3D-Wendelrekonstruktionsalgorithmen.
Materials
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Materials | |||
| Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 s on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| Software | |||
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
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