Elicoidale Organization of Blood fattore VIII della coagulazione su Lipid nanotubi
Summary
Vi presentiamo una combinazione di crio-microscopia elettronica, lipidi nanotecnologie, e analisi della struttura applicata per risolvere la struttura di membrana delle due forme di FVIII altamente omologhi: umane e suine. La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio per organizzare elicoidale le due forme contenenti Fattore VIII ricombinante funzionali su nanotubi di lipidi carichi negativamente (LNT) è descritto.
Abstract
Crio-microscopia elettronica (Cryo-EM) 1 è un approccio efficace per indagare la struttura funzionale di proteine e complessi in uno stato e membrana idratata ambiente 2.
Coagulazione Fattore VIII (FVIII) 3 è un multi-dominio plasma sanguigno glicoproteina. Difetto o carenza di FVIII è la causa di emofilia di tipo A – un disturbo grave emorragia. Dopo l'attivazione proteolitica, FVIII lega alla serina proteasi Factor IXa sulla membrana piastrinica carica negativa, che è fondamentale per la coagulazione 4. Nonostante il ruolo fondamentale FVIII svolge nella coagulazione, informazioni strutturali per il suo stato di membrana è incompleta 5. Ricombinante concentrato di FVIII è il farmaco più efficace contro il tipo emofilia A e commercialmente disponibile FVIII può essere espresso come umano o porcino, entrambi i complessi funzionali che formano con fattore IXa umano 6,7.
"> In questo studio presentiamo una combinazione di crio-microscopia elettronica (Cryo-EM), lipidi nanotecnologia e la struttura di analisi applicato per risolvere la struttura di membrana delle due forme di FVIII altamente omologhi:. Umana e suina La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio organizzare elicoidalmente le due forme Fattore VIII ricombinante funzionali su nanotubi lipidi carichi negativamente (LNT) è descritto. I risultati rappresentativi dimostrano che il nostro approccio è sufficientemente sensibile per definire le differenze nell'organizzazione elicoidale tra i due altamente omologa in sequenza (86% di identità di sequenza proteine). protocolli dettagliati per l'organizzazione elicoidale, Cryo-EM e tomografia elettronica (ET) di acquisizione dati sono dati. L'bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) analisi della struttura applicate per ottenere le ricostruzioni 3D di umana e suina FVIII-LNT è discusso. Le strutture FVIII-LNT umane e suine presentati mostrano le potenzialità della metodologia proposta per Calculate il funzionale, organizzazione legata alla membrana della coagulazione del sangue Fattore VIII ad alta risoluzione.Introduction
Coagulazione del sangue Fattore VIII (FVIII) è un grande glicoproteina di 2332 aminoacidi organizzati in sei settori: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Su trombina attivazione FVIII agisce come cofattore di Fattore IXa all'interno del complesso tenasi legato alla membrana. Il legame di FVIII attivato (FVIIIa) per FIXa in maniera membrana seconda migliora FIXa efficienza proteolitica più di 10 5 volte, che è fondamentale per un efficiente coagulazione del sangue 4. Nonostante il ruolo importante FVIII svolge nella coagulazione e la formazione del complesso tenasi, la struttura FVIII legato alla membrana funzionale è ancora da risolvere.
Per risolvere questo problema, nanotubi doppio strato lipidico (LNT) ricche in fosfatidilserina (PS), in grado di legarsi con alta affinità FVIII 8, 9 e assomiglia alla superficie delle piastrine attivate sono state sviluppate 10. Organizzazione elicoidale consecutivo di FVIII legato a LNT ha dimostrato di essere efficave per la determinazione della struttura di FVIII stato legato alla membrana da Cryo-EM 5. Funzionalizzati LNT sono un sistema ideale per studiare proteina-proteina e proteina-membrana di proteine di membrana associate ad elica organizzato da Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM ha il vantaggio rispetto ai metodi tradizionali strutturali come la cristallografia a raggi X e NMR, come il campione viene conservato in più vicino al ambiente fisiologico (buffer, membrana, pH), senza additivi e isotopi. Nel caso di FVIII, lo studio della struttura di membrana con questa tecnica è ancora più fisiologicamente rilevanti, come la LNT assomigliare per dimensione, forma e composizione pseudopodi delle piastrine attivate in cui i complessi tenasi assemblano in vivo.
Difetti e carenza di FVIII causa Emofilia A, un grave disturbo della coagulazione che colpisce 1 su 5.000 maschi della popolazione umana 4, 6. La maggior parte delle eLa terapia stati efficaci per l'emofilia A è la somministrazione per tutta la vita di FVIII ricombinante umano (hFVIII). Una complicazione significativa della terapia ricombinante FVIII emofilia A è lo sviluppo di anticorpi inibitori per la forma umana che colpisce circa il 30% dei pazienti emofilia A 13. In questo caso, viene utilizzato FVIII porcino (pFVIII) concentrato, come display FVIII suina bassa cross-reattività con anticorpi inibitori contro FVIII umano e forme complessi funzionali con FIXa umana 7. Stabilire l'organizzazione di membrana sia suina e forme di FVIII umani è importante per capire le basi strutturali della funzione cofattore FVIII e implicazioni per emostasi del sangue.
In questo studio, descriviamo una combinazione di nanotecnologie lipidi, Cryo-EM, e analisi della struttura progettata per risolvere l'organizzazione di membrana delle due forme FVIII altamente omologhi. I dati presentati Cryo-EM e strutture 3D per Porci elicoidale organizzataFVIII ne ed umano carica negativa LNT mostra il potenziale del nanotecnologie proposto come base per la determinazione della struttura di FVIII e fattori e complessi in un ambiente membrana fisiologica coagulazione legata alla membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro viene presentato un metodo per distinguere tra due organizzazioni membrana di proteine altamente omologhe: FVIII umano e suino auto-assemblati su nanotubi lipidi nelle condizioni che si verificano nel corpo umano.
Nella procedura descritta, FVIII umano e suino sono organizzati con successo elicoidalmente su nanotubi lipidi, che è la fase più critica. Il prossimo passo fondamentale è quello di preservare il campione in ghiaccio sottile amo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da una concessione nazionale scienziato sviluppo della American Heart Association: 10SDG3500034 e UTMB-BCN start up fondi per SSM. Gli autori riconoscono le strutture Cryo-EM e calcolo scientifico presso il Centro Sealy per la biologia strutturale presso UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), così come Drs. Steve Ludtke e Ed Egelman aiuto con gli algoritmi di ricostruzione elicoidali 2D e 3D.
Materials
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Materials | |||
| Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 s on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| Software | |||
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
Referências
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