Ascorbaat speelt talloze belangrijke rol in cellulair metabolisme, waarvan vele alleen aan het licht in de afgelopen jaren. Hier beschrijven we een middelgrote doorvoer, specifiek en goedkoop microplate assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in celcultuur.
Vitamine C (ascorbaat) speelt talloze belangrijke rol in cellulair metabolisme, waarvan vele alleen aan het licht in de afgelopen jaren. Bijvoorbeeld, in de hersenen, ascorbaat handelt in een neuroprotectieve en neuromodulatory manier die ascorbaat fietsen tussen neuronen en astrocyten vicinaal betreft – een relatie die lijkt cruciaal voor de hersenen ascorbaat homeostase te zijn. Daarnaast opkomende er sterke aanwijzingen dat ascorbaat heeft een sterk uitgebreide rol in het reguleren van de cellulaire en systemische ijzer metabolisme dan is klassiek erkend. De toenemende erkenning van de integrale rol van ascorbaat in normale en gedereguleerde cellulaire en organismale fysiologie vereist een reeks middelgrote doorvoer en zeer gevoelige analytische technieken die kunnen worden uitgevoerd zonder de noodzaak van zeer dure specialistische apparatuur. Hier geven we expliciete instructies een middelgrote doorvoer, specifieke en relatief goedkoop microplate assay voor de bepaling van boe intra-en extracellulaire ascorbaat in celcultuur.
De ontdekking van de chemische aard van ascorbinezuur (vitamine C) en de identificatie als het lang gezochte "anti-scheurbuik factor", door Albert Szent-Györgyi en anderen in papers 1928-1934 1 werden mijlpalen in de geschiedenis biochemie. Inderdaad, deze ontdekkingen hebben bijgedragen aan Szent-Györgyi de toekenning van de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde in 1937. De steeds groeiende reeks van rollen voor ascorbaat in dierlijke en plantaardige fysiologie, evenals de menselijke gezondheid, blijven de onderwerpen van actieve wetenschappelijke zijn onderzoek en controverse.
L-ascorbaat is een overvloedige fysiologisch reductiemiddel en enzym cofactor in zoogdierlijke systemen en draagt talrijke welbepaalde enzymatische reacties die collageen hydroxylering, carnitine en norepinefrine biosynthese, tyrosine metabolisme en peptide hormoon amidering 2. Intrigerend, montage evidence stelt ascorbaat speelt een rol bij het stimuleren van andere ijzer-afhankelijke dioxygenases, zoals prolyl-en asparaginyl hydroxylases betrokken bij de hydroxylering en de gerichtheid van de hypoxia-induceerbare factor (HIFs) 1α en 2α 3. Een recent rapport blijkt dat ascorbaat speelt een rol in de T-cel rijping, door invloed chromatine demethylation via haar activiteiten in het stimuleren van de nucleaire hydroxylases, Jumonji C (JmjC) domein eiwitten; waarvan de laatste lijken te ascorbaat voor de volledige activiteit 4 nodig. Inderdaad lijkt de stimulatie van dergelijke enzymen door ascorbaat plaatsvinden via een vergelijkbaar mechanisme om de stimulatie door ascorbaat van de HIF en collageen hydroxylases. Onder andere klassieke effecten, ascorbaat aanzienlijk bij tot cellulaire antioxidatie als een in water oplosbare keten vrijkomen radicalen 5 en de recycling van plasmamembraan α-tocoferol (vitamine E) via de vermindering van de α-tocopheroxyl groep 6, which is belangrijk bij de bescherming tegen membraan lipide peroxidatie 7. Belangrijk, hoewel de meeste zoogdieren kunnen de novo hepatische synthese van ascorbaat uit D-glucose, hogere primaten, cavia's en sommige knuppels afhankelijk voedingsbronnen van vitamine 8. Dit is vanwege inactivering van de Gulo gen, de orthologen van die onaangetast zoogdieren coderen voor het enzym, γ-gulono-lacton oxidase 9-13. Dit enzym is vereist voor de laatste reactie in ascorbaat biosynthese uit glucose 13.
Na-transporter gemedieerde absorptie vanuit het darmlumen in mensen wordt ascorbaat hele lichaam verspreid door de bloedsomloop. De vitamine is doorgaans te vinden in zijn gereduceerde vorm bij millimolaire concentraties intracellulair (met de opmerkelijke uitzondering van erytrocyten waarin de concentraties zijn meestal vergelijkbaar met de gangbare plasma concentratie), en bij micromolaire concentrations (bijv. 50-200 uM) in de meeste extracellulaire vloeistoffen 14,15.
Onder fysiologische omstandigheden, ascorbaat ondergaat typisch een omkeerbare een elektron oxidatie tot het ascorbinezuur vrije radicalen (AFR, ook bekend als monodehydroascorbate of semidehydroascorbate). Terwijl de AFR is een relatief stabiel radicaal 16, bij het ontbreken van een snelle een-elektron enzymatische reductie terug naar ascorbaat, kunnen twee AFRS dismutate verder een ascorbaat en een dehydroascorbaat (DHA) 9,13,17. In het inwendige van de cel, de twee-elektron oxidatieproduct ascorbaat, DHA, kunnen snel naar ascorbaat verminderd glutathion en NAD (P) H-afhankelijke enzymatische en niet-enzymatische reacties 13.
Hoewel het klassiek wordt aanvaard dat ascorbaat enige belangrijke rol in het metabolisme van ijzer is om de voeding absorptie van non-heem ijzer 18 stimuleren, hebben wij en anderen leverde bewijs strongly suggereert dat ascorbaat speelt een aanzienlijk grotere rol in het metabolisme van dit metaal. Ten eerste lijkt ascorbaat die vrijkomt door ascorbaat-vol-cellen een belangrijke rol spelen bij het moduleren van de opname van niet-transferrine gebonden ijzer door cellen 19,20, en zeer recente gegevens blijkt dat ascorbaat moduleert ook de opname van transferrine gebonden ijzer door cellen 21, deze overeenkomt met een grote fysiologische ijzeropname-route 22.
Ascorbaat is essentieel voor normale centraal zenuwstelsel functie zoogdieren 23,24. Samen met de bijnierschors, hypofyse, thymus, netvlies en gele lichaam, de hersenen bevat hoge concentraties ascorbaat ten opzichte van andere lichaamsweefsels 23,25-27. Bovendien wordt de blootstelling van zowel astrocyten 28,29 en neuron-achtige cellen 30 tot glutamaat waarover de afgifte van ascorbaat leiden in de extracellulaire ruimte, waarbij de ascorbate wordt gedacht om te helpen neuronen beschermt tegen glutamaat-geïnduceerde neuronale dysfunctie 31. Hoewel het exacte mechanisme van glutamaat-geïnduceerde ascorbaat vrijlating uit de astrocyten onbekend is, hebben we onlangs bewijs geleverd waaruit blijkt de betrokkenheid van de cel zwelling veroorzaakt door glutamaat opname door de astrocyten glutamaat en aspartaat transporter (GLAST; ook bekend prikkelende aminozuurtransporter isovorm 1 [EAAT1 ] bij de mens) en daaropvolgende activatie van volume-gevoelige osmolyt en anionkanalen (VSOACs) dat doorlaatbaar is voor kleine organische anionen zoals ascorbaat 32 zijn. De moleculaire identiteit van de plasmamembraan leidingen die deze VSOAC formatie nog worden geïdentificeerd 33,34.
Hoewel veel assays ontwikkeld voor het bepalen van ascorbaat in biologische monsters, die spectrofotometrische, fluorometrische en chromatografische bepalingen 35,36 zijn er grote variatie in specificiteit, gevoeligheid, interference door chemische contaminanten, effectieve lineaire bereik en de stabiliteit van het eindpunt analyt. Bovendien, andere belangrijke factoren beïnvloeden de assay snelheid, gebruiksgemak en toegang tot betrekkelijk gespecialiseerde apparatuur zoals hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) apparaat.
Hier presenteren we een eenvoudige en zeer specifieke colorimetrische microplate assay voor de bepaling van intracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen, evenals een afzonderlijke assay voor de bepaling van ascorbaat-uitstroming uit gekweekte cellen. De laatste test is bedoeld om het probleem van de onderschatting van ascorbaat vrijlating uit de cellen te omzeilen door snelle heropname van vrijgegeven ascorbaat door natrium-afhankelijke ascorbaat transporters (SVCTs). Hoewel beide van deze methoden zijn verschenen in een aantal van onze eerdere publicaties 19,20,32,37,38, dit manuscript biedt een expliciete set van instructies en richtsnoeren voor de daadwerkelijke uitvoering.
In dit artikel presenteren we twee snelle, specifieke en relatief gevoelige colorimetrische microplate assays voor het bepalen van ascorbaat afgeleid van de intra-en extracellulaire compartimenten in gekweekte cellen. De testen kunnen worden aangevuld met toegang tot standaard laboratorium apparatuur en reagentia. Het slechts matig duur reagens die voor de test is AO, die essentieel omdat het zorgt voor een hoge mate van specificiteit analyt naar L-ascorbaat. De testen zijn goed geschikt o…
The authors have nothing to disclose.
Wij zijn dankbaar voor Dr Stephen Robinson en mevrouw Hania Czerwinska (Monash University) voor de genereuze aanbod van astrocyten.
Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
General-purpose buffers | |||
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
General chemicals | |||
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
Glacial acetic acid | |||
0.2 M citric acid | |||
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
30 mM ferene-S | |||
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
AO (120 U/ml) | |||
2.4 mM ferene-S | |||
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |