Een snelle en specifieke Microplate Assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen

Summary

Ascorbaat speelt talloze belangrijke rol in cellulair metabolisme, waarvan vele alleen aan het licht in de afgelopen jaren. Hier beschrijven we een middelgrote doorvoer, specifiek en goedkoop microplate assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in celcultuur.

Abstract

Vitamine C (ascorbaat) speelt talloze belangrijke rol in cellulair metabolisme, waarvan vele alleen aan het licht in de afgelopen jaren. Bijvoorbeeld, in de hersenen, ascorbaat handelt in een neuroprotectieve en neuromodulatory manier die ascorbaat fietsen tussen neuronen en astrocyten vicinaal betreft – een relatie die lijkt cruciaal voor de hersenen ascorbaat homeostase te zijn. Daarnaast opkomende er sterke aanwijzingen dat ascorbaat heeft een sterk uitgebreide rol in het reguleren van de cellulaire en systemische ijzer metabolisme dan is klassiek erkend. De toenemende erkenning van de integrale rol van ascorbaat in normale en gedereguleerde cellulaire en organismale fysiologie vereist een reeks middelgrote doorvoer en zeer gevoelige analytische technieken die kunnen worden uitgevoerd zonder de noodzaak van zeer dure specialistische apparatuur. Hier geven we expliciete instructies een middelgrote doorvoer, specifieke en relatief goedkoop microplate assay voor de bepaling van boe intra-en extracellulaire ascorbaat in celcultuur.

Introduction

De ontdekking van de chemische aard van ascorbinezuur (vitamine C) en de identificatie als het lang gezochte "anti-scheurbuik factor", door Albert Szent-Györgyi en anderen in papers 1928-1934 ¹ werden mijlpalen in de geschiedenis biochemie. Inderdaad, deze ontdekkingen hebben bijgedragen aan Szent-Györgyi de toekenning van de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde in 1937. De steeds groeiende reeks van rollen voor ascorbaat in dierlijke en plantaardige fysiologie, evenals de menselijke gezondheid, blijven de onderwerpen van actieve wetenschappelijke zijn onderzoek en controverse.

L-ascorbaat is een overvloedige fysiologisch reductiemiddel en enzym cofactor in zoogdierlijke systemen en draagt ​​talrijke welbepaalde enzymatische reacties die collageen hydroxylering, carnitine en norepinefrine biosynthese, tyrosine metabolisme en peptide hormoon amidering ^2. Intrigerend, montage evidence stelt ascorbaat speelt een rol bij het ​​stimuleren van andere ijzer-afhankelijke dioxygenases, zoals prolyl-en asparaginyl hydroxylases betrokken bij de hydroxylering en de gerichtheid van de hypoxia-induceerbare factor (HIFs) 1α en 2α ^3. Een recent rapport blijkt dat ascorbaat speelt een rol in de T-cel rijping, door invloed chromatine demethylation via haar activiteiten in het stimuleren van de nucleaire hydroxylases, Jumonji C (JmjC) domein eiwitten; waarvan de laatste lijken te ascorbaat voor de volledige activiteit ⁴ nodig. Inderdaad lijkt de stimulatie van dergelijke enzymen door ascorbaat plaatsvinden via een vergelijkbaar mechanisme om de stimulatie door ascorbaat van de HIF en collageen hydroxylases. Onder andere klassieke effecten, ascorbaat aanzienlijk bij tot cellulaire antioxidatie als een in water oplosbare keten vrijkomen radicalen ⁵ en de recycling van plasmamembraan α-tocoferol (vitamine E) via de vermindering van de α-tocopheroxyl groep ^6, which is belangrijk bij de bescherming tegen membraan lipide peroxidatie ^7. Belangrijk, hoewel de meeste zoogdieren kunnen de novo hepatische synthese van ascorbaat uit D-glucose, hogere primaten, cavia's en sommige knuppels afhankelijk voedingsbronnen van vitamine ^8. Dit is vanwege inactivering van de Gulo gen, de orthologen van die onaangetast zoogdieren coderen voor het enzym, γ-gulono-lacton oxidase ^9-13. Dit enzym is vereist voor de laatste reactie in ascorbaat biosynthese uit glucose ^13.

Na-transporter gemedieerde absorptie vanuit het darmlumen in mensen wordt ascorbaat hele lichaam verspreid door de bloedsomloop. De vitamine is doorgaans te vinden in zijn gereduceerde vorm bij millimolaire concentraties intracellulair (met de opmerkelijke uitzondering van erytrocyten waarin de concentraties zijn meestal vergelijkbaar met de gangbare plasma concentratie), en bij micromolaire concentrations (bijv. 50-200 uM) in de meeste extracellulaire vloeistoffen ^14,15.

Onder fysiologische omstandigheden, ascorbaat ondergaat typisch een omkeerbare een elektron oxidatie tot het ascorbinezuur vrije radicalen (AFR, ook bekend als monodehydroascorbate of semidehydroascorbate). Terwijl de AFR is een relatief stabiel radicaal ^16, bij het ​​ontbreken van een snelle een-elektron enzymatische reductie terug naar ascorbaat, kunnen twee AFRS dismutate verder een ascorbaat en een dehydroascorbaat (DHA) ^9,13,17. In het inwendige van de cel, de twee-elektron oxidatieproduct ascorbaat, DHA, kunnen snel naar ascorbaat verminderd glutathion en NAD (P) H-afhankelijke enzymatische en niet-enzymatische reacties ^13.

Hoewel het klassiek wordt aanvaard dat ascorbaat enige belangrijke rol in het metabolisme van ijzer is om de voeding absorptie van non-heem ijzer ¹⁸ stimuleren, hebben wij en anderen leverde bewijs strongly suggereert dat ascorbaat speelt een aanzienlijk grotere rol in het metabolisme van dit metaal. Ten eerste lijkt ascorbaat die vrijkomt door ascorbaat-vol-cellen een belangrijke rol spelen bij het ​​moduleren van de opname van niet-transferrine gebonden ijzer door cellen ^19,20, en zeer recente gegevens blijkt dat ascorbaat moduleert ook de opname van transferrine gebonden ijzer door cellen ^21, deze overeenkomt met een grote fysiologische ijzeropname-route ^22.

Ascorbaat is essentieel voor normale centraal zenuwstelsel functie zoogdieren ^23,24. Samen met de bijnierschors, hypofyse, thymus, netvlies en gele lichaam, de hersenen bevat hoge concentraties ascorbaat ten opzichte van andere lichaamsweefsels ^23,25-27. Bovendien wordt de blootstelling van zowel astrocyten ^28,29 en neuron-achtige cellen ³⁰ tot glutamaat waarover de afgifte van ascorbaat leiden in de extracellulaire ruimte, waarbij de ascorbate wordt gedacht om te helpen neuronen beschermt tegen glutamaat-geïnduceerde neuronale dysfunctie ^31. Hoewel het exacte mechanisme van glutamaat-geïnduceerde ascorbaat vrijlating uit de astrocyten onbekend is, hebben we onlangs bewijs geleverd waaruit blijkt de betrokkenheid van de cel zwelling veroorzaakt door glutamaat opname door de astrocyten glutamaat en aspartaat transporter (GLAST; ook bekend prikkelende aminozuurtransporter isovorm 1 [EAAT1 ] bij de mens) en daaropvolgende activatie van volume-gevoelige osmolyt en anionkanalen (VSOACs) dat doorlaatbaar is voor kleine organische anionen zoals ascorbaat ³² zijn. De moleculaire identiteit van de plasmamembraan leidingen die deze VSOAC formatie nog worden geïdentificeerd ^33,34.

Hoewel veel assays ontwikkeld voor het bepalen van ascorbaat in biologische monsters, die spectrofotometrische, fluorometrische en chromatografische bepalingen ^35,36 zijn er grote variatie in specificiteit, gevoeligheid, interference door chemische contaminanten, effectieve lineaire bereik en de stabiliteit van het eindpunt analyt. Bovendien, andere belangrijke factoren beïnvloeden de assay snelheid, gebruiksgemak en toegang tot betrekkelijk gespecialiseerde apparatuur zoals hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) apparaat.

Hier presenteren we een eenvoudige en zeer specifieke colorimetrische microplate assay voor de bepaling van intracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen, evenals een afzonderlijke assay voor de bepaling van ascorbaat-uitstroming uit gekweekte cellen. De laatste test is bedoeld om het probleem van de onderschatting van ascorbaat vrijlating uit de cellen te omzeilen door snelle heropname van vrijgegeven ascorbaat door natrium-afhankelijke ascorbaat transporters (SVCTs). Hoewel beide van deze methoden zijn verschenen in een aantal van onze eerdere publicaties ^{19,20,32,37,38,} dit manuscript biedt een expliciete set van instructies en richtsnoeren voor de daadwerkelijke uitvoering.

Protocol

1. Bepaal Intracellular Ascorbate in gekweekte cellen Celcultuur en oogsten Grow schorsing (bv. menselijke erythroleukemie, K562) of aanhangende cellen (bijv. primaire astrocyten) met behulp van standaard cultuur procedures 19-21,32,38. Opmerking: om ervoor te zorgen cellen bevatten ascorbaat, laden gekweekte cellen met ascorbaat hetzij als ascorbaat of DHA 33,39. Maak een-ascorbaat met cellulaire extract <o…

Representative Results

Bepaling van intracellulaire Ascorbate in gekweekte suspensiecellen In het eerste assay (figuur 1), wordt bepaald intracellulaire ascorbaat, na ascorbaat-specifieke (bijvoorbeeld AO-gevoelige) reductie van ferricyanide tot ferrocyanide, met de zeer gevoelige bepaling van ferrocyanide een eerder gepubliceerde werkwijze 37. De detectie van ascorbaat is gebaseerd op de colorimetrische chelatie van ferro-ijzer dat wordt gegenereerd door de ascorbaat-afhankelijke…

Discussion

In dit artikel presenteren we twee snelle, specifieke en relatief gevoelige colorimetrische microplate assays voor het bepalen van ascorbaat afgeleid van de intra-en extracellulaire compartimenten in gekweekte cellen. De testen kunnen worden aangevuld met toegang tot standaard laboratorium apparatuur en reagentia. Het slechts matig duur reagens die voor de test is AO, die essentieel omdat het zorgt voor een hoge mate van specificiteit analyt naar L-ascorbaat. De testen zijn goed geschikt o…

Materials

Nunc 96-well flat-bottom plates	Thermo	269620	Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge	Eppendorf	5415D	A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge	Eppendorf	5810R	Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer	Bio-Rad		Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)	Eppendorf		This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich		Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer	Sigma-Aldrich	30790	Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt)	Sigma-Aldrich	92940
Sodium L-glutamate	Sigma-Aldrich
L-glutamine	Sigma-Aldrich
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate