Polarisation-basierte Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) ermöglicht die Echtzeit-Erkennung von Zellmembrandynamik. Dieser Artikel beschreibt die Umsetzung der pTIRFM für das Studium der Membran Umbau während regulierten Exozytose. Die Technik ist generalisierbar auf andere Prozesse in der Zellbiologie, die Veränderungen in Membranform, die direkt oder indirekt beteiligen.
Um neue Einblicke in die Dynamik der Exozytose zu gewinnen, konzentriert sich unsere Gruppe auf die Veränderungen der Lipiddoppelschicht Form, die gerade in der Verschmelzung von Vesikel und Plasmamembran reguliert werden muss. Diese rasche und lokalisierte Änderungen werden durch dynamische Wechselwirkungen zwischen Lipiden und Proteinen, die spezialisierte Membrankrümmung Steuerung erreicht. Das Fehlen solcher Wechselwirkungen nicht nur verheerende Folgen für die Fusion von Vesikeln, sondern eine Vielzahl von anderen Zellfunktionen, die Steuerung der Membranform beinhalten. In den letzten Jahren hat die Identität einer Anzahl von Proteinen mit Membran-Formgebungseigenschaften bestimmt. Was bleibt, fehlt, ist ein Fahrplan, wann, wo und wie sie als Fusions und Content-Release Fortschritte zu handeln.
Unser Verständnis der molekularen Ereignisse, die Membran zu ermöglichen Umbau ist historisch durch einen Mangel an analytischen Methoden, die empfindlich auf Membrankrümmung sind oder die zeitliche Auflösung auf trac beschränktk schnellen Veränderungen. PTIRFM erfüllt beide Kriterien. Wir diskutieren, wie pTIRFM wird implementiert, um eine schnelle, Submikron Veränderungen in der Ausrichtung der chromaffinen Zellmembranen während dichten Kern Vesikel (DCV)-Fusions visualisieren und zu interpretieren. Die chromaffinen Zellen, die wir verwenden, werden aus Rindernebennieren isoliert. Die Membran ist mit einem lipophilen Carbocyaninfarbstoff, 1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorbenzolsulfonat gefärbt, oder hat. DiD interkaliert in der Membranebene mit einem "festen"-Orientierung und ist daher empfindlich gegenüber der Polarisation des abklingenden Feldes. Die DID-gefärbten Zellmembran nacheinander aufgeregt mit orthogonalen Polarisationen eines 561-nm-Laser (p-pol, s-pol). Ein 488-nm-Laser verwendet, um Bläschen Bestandteile und Zeit visualisieren der Moment der Fusion. Exozytose durch lokal Perfusion Zellen mit einem depolarisierenden KCl-Lösung ausgelöst. Die Analyse erfolgt offline mit speziell geschriebenen Software zu verstehen, wie diD durchgeführtEmissionsintensität Änderungen betreffen Fusionspore Dilatation.
Die ordnungsgemäße Durchführung der Exozytose erfordert extreme Veränderungen in der Membran-Doppelschicht Form präzise orchestriert werden. Vor der Fusion lokale Biegung der Plasmamembran unter dem Granulat tritt teil um die Energiebarriere für die Wechselwirkung von Doppelschichten zu reduzieren. Später, als Membranen fusionieren, Bereiche hoher Krümmung erzeugt und stabilisiert werden müssen. Schließlich muss abgesichert Membranen aus ihrer Ausgangsform gebogen, um die Fusionspore erweitern und ermöglichen Content-Release 1 werden. Da es unwahrscheinlich ist, solche dramatischen Veränderungen unterziehen und koordinierte Membranen allein, sind Proteine, die erforderlich sind, um Ereignisse zu vermitteln. Aber, wie sie handeln, um Änderungen in der Membrantopologie während des Fusionsprozesses beeinflussen nach wie vor sehr viel offen.
Excellent in-vitro-Modelle existieren, um Membrankrümmung zu visualisieren. Die Verwendung von Negativ-Fleck EM, zum Beispiel, hat sich für die Gestaltung der aktuellen Molekülmodelle für die Handlungen der beiden großen Handel p wichtigroteins – Synaptotagmin und Dynamin (für Übersichten siehe Chapman 2 und Henshaw 3). Die meisten Echtzeit-Assays der Exozytose Krümmung nicht direkt zu erkennen. Stattdessen wird Krümmung von Assays, die auf die Kinetik der Lumenfracht Release 8.4 oder Änderungen in der Membranfläche 11.9 berichten abgeleitet. PTIRFM schließt die Lücke zwischen in vivo und in vitro-Studien durch, die direkten Echtzeit-Messungen von Veränderungen in der Membran-Mikromorphologie.
PTIRFM, in einer nicht-abbildenden Modus wurde von Axelrod und Kollegen Pionierarbeit geleistet, um die Ausrichtung der NPD-PE innerhalb einer Modellmembran 12 eingebaut zu messen. Die Technik wurde dann an den dynamischen Veränderungen in lebenden Zellen mit Dii und FM1-43 13-18 beschriftet visualisieren. In pTIRFM werden zwei Evaneszentfeld Polarisationen verwendet werden, um sequentiell erregt eine Membran eingebettete Sonde: p-Polarisation (in der Einfallsebene) und s-Polarisation (senkrecht zur Einfallsebene). Vor der Bilderzeugung, die Sonde – in diesem Fall hat – wird kurz zum extrazellulären Medium zugegeben und kann sich in den Plasmamembranen der Zellen zu unter interkalieren. In Regionen, in denen die Membran nicht parallel zu der Deckglas (wie in einer Membran Rüschen oder Vertiefung), der tat auch nicht parallel sein. Daher werden solche Bereiche erregbar durch die p-pol Strahl sein. Die p-pol Strahl weniger effektiv anregen diD in Membranbereichen, die meist parallel zur Deckglas sind. Pixel-to-Pixel-Verhältnis Bilder (P / S) die Berichterstattung über die Emission von sequentiellen p-und s-pol Anregung der DID wird daher speziell hervorzuheben Regionen der Membranverformung. In der Theorie sind die P / S-Verhältnis lassen sich empfindlich auf kleine Winkel der Plasmamembran Abweichung vom Deckglas, mit der Amplitude der Änderungen durch Computersimulationen vorhergesagt, 18. P / S lassen sich auch unabhängig von Fluorophor Abstand von der Deckglasoberfläche und lokalen FluorophorKonzentration. Lokale Fluorophorkonzentration anstelle von Bildern Berichterstattung über die Pixel-zu-Pixel-Summe des P-Emission und 2-fachen der S-Emissions (P +2 S) vorgesehen ist. Die P + 2S Messung empfindlich auf die genaue Geometrie der Vertiefung, wobei einige, wenig oder keine Änderung möglich. Dies kann durch Computersimulationen gezeigt werden, dass Modellübergänge einer Fusionspore von einem frühen (dh mit einem schmalen Hals) auf einen späteren Zustand 16,18. Die P + 2S eines kondensierten Vesikel über einen schmalen Hals an der Plasmamembran gebunden (und mit mehr tat nahe der Grenzfläche) wird vorhergesagt, größer zu sein, als beispielsweise die eines Vesikel fusioniert mit einer viel breiteren Poren (wo die getan hat, ist in der dunkelsten Teil des evaneszenten Feld).
In diesem Artikel besprechen wir, wie pTIRFM implementiert und verwendet, um die schnelle, lokale Veränderungen in der Membranform, die während der Fusionspore Dilatation auftreten studieren. Während nur eine Anwendung ist ausdrücklich discussed sind die Verfahren verallgemeinerbar zu einer Vielzahl von anderen Zell biologischen Prozesse, die direkt oder indirekt mit dem Membran Umbau.
Polarisation basierende TIRFM erkennt schnell, submikroskopische Veränderungen in der Membran-Topologie. Die Umsetzung der Technik ist relativ einfach, insbesondere, wenn TIRF-Optik sind bereits vorhanden. Alles, was benötigt wird, ist eine Viertelwellenplatte, zwei Polarisationswürfel, und Fensterläden zu p-pol-und s-pol Beleuchtung Wege zu trennen. Die genaue Position dieser Komponenten auf dem Tisch ist in der Regel von Speicherplatz bestimmt.
Um die Membran topologische Informationen zu erhalten, sollte die fluoreszierende Sonde verwendet mit einer festen oder bekannten Orientierung einzulagern. Die Technik, wie in diesem Artikel beschrieben wird, nimmt die Verwendung Carbocyaninfarbstoffen aber auch andere Farbstoffe, wie FM1-43 14, können ebenfalls verwendet werden. Die Membran Färbeverfahren selbst ist unkompliziert. Kultivierte Zellen benötigen nur eine sehr kurze Exposition (weniger als 10 Sek.), um eine kleine Menge der Dii / tat, um üppige Kennzeichnung der Membran zu erhalten. Hinzufügen von überschüssiger Farbstoff führt zu Lichtstreuung AGGREGAtes auf dem Glas, die Bildqualität zu verringern. Über Inkubieren von Zellen mit Farbstoff führt zur Internalisierung, die nachteilige Auswirkungen auf die Bildqualität und möglicherweise die Lebensfähigkeit der Zellen hat zu färben. Wenn eine Zelle ist gut gefärbt, gibt es klare Unterscheidung in der P-und S-Emission-Bildern. Wie in 2A gezeigt, wird die P-Emissions anschaulich markieren Bereiche der Membran, die Deck schräge (dh die Kanten der Zelle Fußabdruck) sind, während der S-Emissionsintensität annähernd gleichförmig über die Grundfläche Zelle sein. Wenn ein deutlicher Unterschied zwischen P und S, ist nicht ersichtlich, ist es möglich, dass die Zelle nur schlecht auf dem Substrat haften oder die Zellmembran nicht gesund ist, und die Zelle ist nicht für die Experimente verwendet.
Unsere bisherigen Studien beschreiben pTIRFM genutzt DII als Fluoreszenzsonde Membran. Hier nutzen wir das gemacht haben weil es für Dual-Farb-Imaging Experimente, die GFP / pHluorin wie die anderen Fluorophor beschäftigen ist. Wir begeistern diD with ein 561-nm-Laser statt 640 nm Laser (die näher an seine Anregung Gipfel ist), weil die Fluorophor Bleichmittel schneller bei 640 nm auf. Trotz der Tatsache, dass der 561-nm-Laser ist auf dem Schwanz tat veröffentlicht Anregungsspektrum, Fluoreszenz effizient emittiert. Ein weiterer Vorteil der 561-nm-Laser ist, dass es regt beide Dii Und hat es uns ermöglicht, die gleiche Polarisation Setup für die beiden Sonden zu verwenden. Man beachte, dass die Orientierung des Fluorophors in der Membran wird die Auslegung der Membrantopologie beeinflussen. Wenn beispielsweise ein Fluorophor wurden mit Übergangsdipole senkrecht zur Membranebene orientiert ist (anstatt parallel oder nahezu parallel, wie es der Fall mit DII oder hat), dann nicht planaren Membranregionen werden leichter durch die S markiert werden, anstatt die P-Emission.
Wir haben auch für die Isolierung und Elektroporation von Rinder-Nebennieren-chromaffinen Zellen beschriebenen Techniken. Die Rinderchromaffinen Zellen ist ein hervorragendes secretory Modell. Es hat die Vorteile, dass sie leicht in Kultur, die auf einer Vielzahl von Sekretagogen halten und besitzen große sekretorische Vesikel, die ohne weiteres mit konventionellen Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Fluoreszierende Proteine exprimieren, werden die Zellen in Suspension vor dem Beschichten auf Kollagen behandelten Kulturschalen elektroporiert. Nach unserer Erfahrung ist Expressionseffizienz mit Elektroporation viel höher als entweder mit Ca 2 +-Phosphat-oder Lipofectamine Reagenzien. Der Nachteil der Elektroporation ist, dass es mehr Zellen benötigt (wie viele den Prozess nicht überleben), kommerziellen und teuren Reagenzien. Aus Gründen, die uns unklar sind, beinhaltet nicht jede Membran taten. Außerdem wird nur ein Bruchteil der Zellen auf der Schale transfiziert. Die Suche nach Zellen, die transfiziert werden und sind mit diD befleckt kann zeitaufwendig sein, weshalb die Optimierung Bedingungen für die Färbung und Elektroporation ist die Mühe wert.
Zusammenfassend, das einArtikel beschreibt, wie pTIRFM wird implementiert, um die rasche und lokalisierte Membran Verformungen, die bei der Fusion von Vesikeln dichten Kern in Rinderchromaffinen Zellen auftreten überwachen. Obwohl nur eine Anwendung beschrieben, ist die Technik ideal für die Untersuchung von anderen biologischen Prozessen, Veränderungen in Membranform, einschließlich Endozytose, Zytokinese und Zellmotilität beinhalten geeignet.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wird durch einen Nationalen Entwicklungs Scientist Grant (13SDG14420049) auf AA von der American Heart Association und Start-up-Fonds von der Wayne State University unterstützt. Wir danken Dr. Ronald W. Holz und Dr. Maria Bittner für die Beratung in Bezug auf die Rindernebennierenpräparate und Dr. Daniel Axelrod für die Unterstützung bei der pTIRFM Set-up und hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Syt-1 wurde mit pHluorin verwendet Genehmigung von Dr. Gero Miesenböck (University of Oxford). GCAMP5G wurde durch Addgene erhalten. Wir danken James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman und Praneeth Katrapti mit Hilfe auf die Optimierung der verschiedenen Schritte der beschriebenen Verfahren.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |