Basato polarizzazione-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) permette un rilevamento in tempo reale della dinamica della membrana cellulare. Questo articolo descrive l'implementazione di pTIRFM per lo studio della membrana rimodellamento durante l'esocitosi regolata. La tecnica è generalizzabile ad altri processi in biologia cellulare che coinvolgono direttamente o indirettamente cambiamenti di forma della membrana.
Per ottenere nuove intuizioni le dinamiche di esocitosi, il nostro gruppo si concentra sui cambiamenti di forma doppio strato lipidico che devono essere regolati proprio durante la fusione delle membrane delle vescicole e di plasma. Questi cambiamenti rapidi e localizzati sono raggiunti da interazioni dinamiche tra lipidi e proteine specializzate che controllano membrana curvatura. L'assenza di tali interazioni non solo avrebbe conseguenze devastanti per la fusione delle vescicole, ma una miriade di altre funzioni cellulari che coinvolgono control forma di membrana. Negli ultimi anni, l'identità di un numero di proteine con proprietà membrane-shaping è stata determinata. Ciò che rimane manca è una tabella di marcia di quando, dove e come agiscono, come la fusione e il progresso di rilascio dei contenuti.
La nostra comprensione degli eventi molecolari che consentono il rimodellamento della membrana è stato storicamente limitato dalla mancanza di metodi analitici che sono sensibili a membrana curvatura o hanno la risoluzione temporale di track rapidi cambiamenti. PTIRFM soddisfa entrambi i criteri. Discutiamo come pTIRFM viene implementato per visualizzare e interpretare i cambiamenti rapidi e inferiori al micron nell'orientamento delle membrane delle cellule cromaffini durante nucleo denso di vescicole (DCV) fusion. Le cellule cromaffini che usiamo sono isolati dalle ghiandole surrenali bovini. La membrana viene trattato con un colorante carbocyanine lipofila, 1,1 '-dioctadecil-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4 chlorobenzenesulfonate, o fatto. DiD intercala nel piano membrana con un orientamento "fisso" ed è quindi sensibile alla polarizzazione del campo evanescente. La membrana cellulare DID macchiato è sequenziale eccitato con polarizzazioni ortogonali di un laser a 561 nm (p-pol, s-pol). Un laser 488 nm è usato per visualizzare costituenti vescicole e tempo il momento della fusione. Esocitosi è innescato da localmente perfusione delle cellule con una soluzione di KCl depolarizzante. L'analisi viene eseguita offline utilizzando software personalizzato scritto per capire come ha fattoemissione cambiamenti di intensità riguardano la fusione dei pori dilatazione.
La corretta esecuzione della esocitosi richiede cambiamenti estremi di forma doppio strato di membrana deve essere orchestrato con precisione. Prima della fusione, curvatura locale della membrana plasmatica sotto il granulo si verifica, in parte per ridurre la barriera di energia per l'interazione di bistrati. Più tardi, come le membrane si fondono, zone di alta curvatura vengono generate e devono essere stabilizzati. Infine, le membrane fusi devono essere piegati dalla loro forma iniziale per espandere il poro di fusione e permettere il rilascio dei contenuti 1. Poiché le membrane da soli è improbabile di sottoporsi a tali cambiamenti drammatici e coordinate, le proteine sono necessarie per mediare eventi. Ma come si comportano influenzare cambiamenti di topologia di membrana durante il processo di fusione rimane molto una questione aperta.
Eccellente de modelli in vitro esistono per visualizzarne la membrana curvatura. L'uso di colorazione negativa EM, per esempio, è stato importante per plasmare modelli molecolari correnti per le azioni di due grandi traffici proteins – synaptotagmin e dynamin (per le recensioni, vedere Chapman 2 e 3 Henshaw). La maggior parte delle analisi in tempo reale di esocitosi non rilevano direttamente curvatura. Invece, la curvatura è dedotto da saggi che riportano sulla cinetica di rilascio lumenal carico 4-8 o cambiamenti nella zona della membrana 9-11. PTIRFM colma il divario tra in vivo e in vitro, consentendo diretti, misure in tempo reale dei cambiamenti nella membrana micromorfologia.
PTIRFM, in un modo nonimaging, è stato lanciato da Axelrod e colleghi per misurare l'orientamento della NPD-PE incorporato all'interno di un modello di membrana 12. La tecnica è stata poi applicata per visualizzare i cambiamenti dinamici nelle cellule viventi etichettati con DII e FM1-43, 13-18. In pTIRFM, due polarizzazioni campo evanescente sono utilizzate per eccitare sequenzialmente una sonda membrana incorporato: p-polarizzazione (nel piano di incidenza) e s-polarizzazione (perpendicolare al piano di incidenza). Prima di imaging, la sonda – in questo caso, DID – viene brevemente aggiunto al mezzo extracellulare ed è permesso di intercalare nelle membrane plasmatiche delle cellule da studiare. Nelle regioni in cui la membrana è non paralleli al coprioggetti (come in un volant membrana o rientro), il DID sarà anche non paralleli. Pertanto, tali regioni saranno eccitabile dal fascio p-pol. Il fascio p-pol sarà meno efficacemente eccitare ha fatto nelle regioni di membrana che sono per lo più paralleli al coprioggetti. Immagini rapporto pixel-to-pixel (P / S) relazioni sulle emissioni da sequenziale p-e s-pol eccitazione Lo sarà quindi in particolare evidenza le regioni di membrana deformazione. In teoria, le immagini rapporto P / S sono sensibili anche a piccoli angoli di deviazione dalla membrana plasmatica coprioggetti, con l'ampiezza dei cambiamenti previsti da simulazioni al computer 18. Immagini P / S sono indipendenti le fluoroforo distanza dalla superficie coprioggetti e fluoroforo localeconcentrazione. Concentrazione del fluoroforo locale è invece fornito da segnalare immagini sulla somma pixel-per-pixel dell'emissione P e 2 volte l'emissione S (P +2 S). Il P +2 misure S è sensibile alla geometria precisa del rientro, con qualche, poco o nessun cambiamento possibile. Questo può essere dimostrato da simulazioni al computer che modellano le transizioni di un poro di fusione da un precoce (cioè con un collo stretto) ad uno stato più tardi 16,18. Il P +2 S di una vescicola fuso attaccato alla membrana plasmatica tramite un collo stretto (e con più DID vicino all'interfaccia) è previsto per essere maggiore, ad esempio, a quella di una vescicola fuso con un poro molto più ampia (dove l' Lo è all'interno della parte più debole del campo evanescente).
In questo articolo, vedremo come pTIRFM viene implementato e utilizzato per studiare i cambiamenti rapidi e localizzati in forma di membrana che si verificano durante la fusione dei pori dilatazione. Mentre una sola applicazione è esplicitamente discussed, i metodi sono generalizzabili a una varietà di altri processi biologici cellulari che coinvolgono direttamente o indirettamente membrana rimodellamento.
TIRFM base di polarizzazione rileva cambiamenti rapidi e submicroscopici nella topologia di membrana. Implementare la tecnica è relativamente semplice, soprattutto se l'ottica TIRF sono già in atto. Tutto quello che serve è un piatto a quarto d'onda, due cubi polarizzatori, e tapparelle per separare i percorsi p-pol e illuminazione s-pol. La posizione precisa di questi componenti sul tavolo è solitamente dettata dalla spazio disponibile.
Per ottenere informazioni membrana topologica, la sonda fluorescente utilizzato deve intercalare con un orientamento fisso o conosciuto. La tecnica, come descritto in questo articolo, presuppone l'utilizzo di coloranti carbocyanine ma altri coloranti, come FM1-43 14, possono anche essere utilizzati. La procedura di colorazione membrana stessa è semplice. Cellule coltivate richiedono solo una breve esposizione (meno di 10 sec) ad una piccola quantità di DII / DID per ottenere l'etichettatura esuberante della membrana. L'aggiunta di colorante in eccesso porta alla luce dispersione AGGREGAtes sul vetro che diminuiscono la qualità dell'immagine. Over-incubando le cellule con colorante porta a tingere di interiorizzazione che ha effetti dannosi sulla qualità dell'immagine e possibilmente la vitalità cellulare. Se una cella è macchiato bene, ci sarà chiara distinzione nelle immagini di emissione P e S. Come mostrato in Figura 2A, l'emissione P sarà vividamente evidenziare aree della membrana che sono oblique coprioggetto (cioè i bordi del footprint cella) mentre l'intensità di emissione S sarà all'incirca uniforme su impronta cella. Se una chiara distinzione tra P e S non è evidente, allora è possibile che la cellula è scarsamente aderire al substrato o la membrana cellulare non è sano, e la cella non viene utilizzato per esperimenti.
Nostri studi precedenti che descrivono pTIRFM utilizzati Dii come la sonda fluorescente membrana. Qui, utilizziamo fatto perché è adatto per gli esperimenti di imaging a due colori che impiegano GFP / pHluorin come l'altro fluoroforo. Si eccitano DID wi° Un laser 561 nm anziché 640 nm laser (che è più vicino al suo picco eccitazione) perché i candeggianti più rapidamente fluoroforo a 640 nm. Nonostante il fatto che il laser 561 nm è sulla coda Lo spettro di eccitazione pubblicato, la fluorescenza emessa efficiente. Un altro vantaggio del laser 561 nm è che si eccita entrambi i Dii e ha fatto ci permette di utilizzare la stessa configurazione di polarizzazione per entrambe le sonde. Notare che l'orientamento del fluoroforo nella membrana influenzerà l'interpretazione della topologia membrana. Ad esempio, se un fluoroforo erano orientati con i suoi dipoli di transizione perpendicolare al piano di membrana (anziché parallelo, o quasi parallelo, come è il caso con DII o DID), poi regioni di membrana non planari saranno più facilmente evidenziata dalla S anziché l'emissione P.
Abbiamo anche descritto le tecniche per l'isolamento e l'elettroporazione di cellule cromaffini surrenali bovine. La cella cromaffine bovina è un ottimo smodello ecretory. Ha il vantaggio di essere facile da mantenere in coltura, sensibile ad una varietà di secretogogues, e possedendo grandi vescicole secretorie che sono prontamente visualizzabili alla microscopia ottica convenzionale. Per esprimere proteine fluorescenti, le cellule sono elettroporati in sospensione prima di placcatura sulla cultura piatti collagene trattati. Nella nostra esperienza, efficienza espressione è molto più alto con elettroporazione che sia con Ca 2 +-fosfato o reagenti lipofectamina. Lo svantaggio di elettroporazione è che richiede più celle (come molti non sopravvivere al processo) e reagenti commerciali costosi. Per ragioni che non sono chiare per noi, non ogni membrana incorpora DID. Inoltre, solo una frazione delle cellule sul piatto vengono transfettate. Trovare cellule che sono transfettate E sono macchiati bene con Lo può richiedere molto tempo, che è il motivo per ottimizzare le condizioni per la colorazione ed elettroporazione è valsa la pena.
In sintesi, unArticolo descrive come pTIRFM viene implementato per monitorare le deformazioni della membrana rapidi e localizzati che si verificano durante la fusione delle vescicole nucleo denso di cellule cromaffini bovine. Anche se una sola applicazione è discusso, la tecnica è ideale per lo studio di altri processi biologici che coinvolgono cambiamenti nella forma di membrana, tra cui l'endocitosi, citochinesi, e la motilità cellulare.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è supportata da una Scientist Development Grant National (13SDG14420049) per AA dalla American Heart Association e fondi di start-up dalla Wayne State University. Siamo in debito con il dottor Ronald W. Holz e il Dr. Mary Bittner per fornire consulenza per quanto riguarda i preparativi surrenali bovina e Dr. Daniel Axelrod per l'assistenza con il pTIRFM set-up e utili commenti sul manoscritto. Syt-1 pHluorin è stato utilizzato con permesso del Dr. Gero Miesenböck (Università di Oxford). GCAMP5G è stato ottenuto attraverso Addgene. Ringraziamo James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman, e Praneeth Katrapti con l'aiuto sull'ottimizzazione varie fasi delle procedure descritte.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |