À polarisation selon une réflexion interne totale microscopie de fluorescence (pTIRFM) permet la détection en temps réel de la dynamique de la membrane cellulaire. Cet article décrit la mise en œuvre de pTIRFM pour l'étude du remodelage de la membrane lors de l'exocytose régulée. La technique est généralisable à d'autres processus en biologie cellulaire qui impliquent directement ou indirectement changements dans la forme de la membrane.
Pour obtenir des informations nouvelles sur la dynamique de l'exocytose, notre groupe met l'accent sur les changements dans la forme de bicouche lipidique qui doivent être précisément réglementées lors de la fusion de vésicules et de plasma membranes. Ces changements rapides et localisées sont atteints par des interactions dynamiques entre les lipides et les protéines spécialisées qui contrôlent la courbure de la membrane. L'absence de ces interactions pourrait non seulement avoir des conséquences dévastatrices pour la fusion des vésicules, mais une foule d'autres fonctions cellulaires qui impliquent le contrôle de la forme de la membrane. Au cours des dernières années, l'identité d'un certain nombre de protéines ayant des propriétés de mise en forme de membrane a été déterminée. Ce qui reste manquant est une feuille de route de quand, où, et comment ils agissent comme la fusion et le contenu libération progrès.
Notre compréhension des événements moléculaires qui permettent le remodelage de la membrane a toujours été limitée par un manque de méthodes d'analyse qui sont sensibles à la courbure de la membrane ou avoir la résolution temporelle à track changements rapides. PTIRFM satisfait à ces deux critères. Nous discutons de la façon pTIRFM est mis en œuvre pour visualiser et interpréter changements rapides et submicroniques dans l'orientation des membranes cellulaires chromaffines pendant dense noyau vésicule (DCV) fusion. Les cellules chromaffines que nous utilisons sont isolées de glandes surrénales bovines. La membrane est colorée avec un colorant carbocyanine lipophile, 1,1 '-dioctadécyl-3, 3,3', 3 'tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzène, ou a fait. DiD intercale dans le plan de la membrane avec une orientation "fixe" et est donc sensible à la polarisation du champ évanescent. La membrane cellulaire n'a taché est successivement excités avec des polarisations orthogonales d'un laser 561 nm (p-pol, s-pol). Un laser 488 nm est utilisé pour visualiser les mandants et les temps vésicules moment de la fusion. Exocytose est déclenchée par perfusion locale cellules avec une solution de KCl dépolarisant. L'analyse est effectuée hors ligne en utilisant un logiciel écrit sur mesure de comprendre comment at-changements d'intensité des émissions liées à la fusion dilatation des pores.
La bonne exécution de l'exocytose nécessite des changements extrêmes de forme bicouche de membrane à être orchestrée précisément. Avant la fusion, la flexion locale de la membrane plasmique dans le cadre du granule se produit, en partie pour réduire la barrière d'énergie d'interaction de bicouches. Plus tard, en tant que membranes fusionnent, les zones de forte courbure sont générés et doivent être stabilisées. Enfin, les membranes fusionnées doivent être pliés de leur forme initiale d'étendre le pore de fusion et permettre la libération de contenu 1. Parce que seuls les membranes ne sont pas susceptibles de subir ces changements spectaculaires et coordonnés, les protéines sont nécessaires à la médiation des événements. Mais comment ils agissent pour influencer les changements de topologie de la membrane au cours du processus de fusion reste très ouverte.
Bon modèles in vitro existent pour visualiser courbure de la membrane. L'utilisation de coloration négative EM, par exemple, a joué un rôle important pour façonner des modèles moléculaires actuelles pour les actions de deux grands trafics proteins – synaptotagmine et dynamine (pour revue, voir Chapman et 2 Henshaw 3). La plupart des tests en temps réel de l'exocytose ne détectent pas directement courbure. Au lieu de cela, la courbure est déduit à partir d'essais qui rendent compte de la cinétique de libération de la cargaison luminal 4-8 ou des changements de surface de membrane 9-11. PTIRFM comble le fossé entre in vivo et des études in vitro, en permettant des mesures directes en temps réel de l'évolution de la micromorphologie de membrane.
PTIRFM, dans un mode non imageur, a été lancée par Axelrod et ses collègues pour mesurer l'orientation du NPD-PE incorporé dans une membrane modèle 12. La technique a ensuite été appliquée à visualiser les changements dynamiques dans les cellules vivantes marquées par Dii et FM1-43 13-18. Dans pTIRFM, deux polarisations des champs évanescents sont utilisés pour exciter séquentiellement une sonde de membrane-embedded: p-polarisation (dans le plan d'incidence) et de polarisation S (perpendiculaire au plan d'incidence). Avant l'imagerie, la sonde – dans ce cas, n'a – est brièvement ajouté dans le milieu extracellulaire et est autorisé à s'intercaler dans les membranes plasmiques des cellules à étudier. Dans les régions où la membrane est non parallèle à la lamelle (comme dans une ruche de membrane ou indentation), DID aura également non parallèles. Par conséquent, ces régions seront excitable par le faisceau p-pol. Le faisceau p-pol sera moins efficace exciter n'a dans les régions de la membrane qui sont principalement parallèles à la lamelle. Images ratio pixel à pixel (P / S) des rapports sur l'émission du séquentiel p et s-pol excitation de DID donc souligner spécifiquement les régions de déformation de la membrane. En théorie, le rapport des images P / S sont sensibles à même de petits angles de déviation de la membrane plasmique de la lamelle, à l'amplitude des changements prédits par des simulations sur ordinateur 18. Images P / S sont également indépendants de la distance de fluorophore à partir de la surface de la lamelle et fluorophore localeconcentration. Concentration en fluorophore local est fourni à la place des images par rapport à la somme de rapports pixel à pixel P de l'émission et de deux fois l'émission de S (P 2 S). La mesure de la 2 P S est sensible à la géométrie précise de l'indentation, avec certains, peu ou pas de changement possible. Cela peut être démontré par des simulations informatiques que les transitions de modèle d'un pore de fusion d'un début (c'est à dire avec un col étroit) à un état plus tard 16,18. Le P 2 S d'une vésicule condensé attaché à la membrane plasmique par l'intermédiaire d'un col étroit (et à plus forte raison à proximité de l'interface) est prévu pour être plus grand, par exemple, que celui d'une vésicule fusionné avec un pore beaucoup plus large (où l' DID est dans la partie le plus sombre du champ évanescent).
Dans cet article, nous discutons de la façon pTIRFM est mis en œuvre et utilisé pour étudier les changements rapides et localisées en forme de membrane qui se produisent lors de la fusion dilatation des pores. Bien qu'une seule application est explicitement discussed, les méthodes peuvent être généralisés à une variété d'autres processus biologiques cellulaires impliquant directement ou indirectement le remodelage de la membrane.
TIRFM à polarisation détecte, les changements microscopiques rapide de la topologie de la membrane. Mise en œuvre de la technique est relativement simple, surtout si l'optique FRBR sont déjà en place. Tout ce qui est nécessaire est une lame quart d'onde, deux cubes de polarisation, et les volets pour séparer les chemins p-pol et éclairage s-pol. La position précise de ces composants sur la table est généralement dicté par l'espace disponible.
Afin d'obtenir des informations topologiques membrane, la sonde fluorescente utilisé ne doit s'intercaler avec une orientation fixe ou connue. La technique, telle que décrite dans cet article, suppose l'utilisation de colorants de carbocyanine, mais d'autres colorants, tels que FM1-43 14, peuvent également être utilisés. La procédure de coloration de la membrane elle-même est simple. Les cellules cultivées n'ont besoin que d'une très courte exposition (moins de 10 secondes) à une petite quantité de DII / SDA pour obtenir l'étiquetage exubérante de la membrane. Ajout excès de colorant conduit à la diffusion de la lumière AGGREGAtes sur la vitre qui diminuent la qualité d'image. Plus-incubant les cellules avec un colorant pour teindre internalisation conduit qui a des effets néfastes sur la qualité de l'image et, éventuellement, la viabilité des cellules. Si une cellule est bien colorée, il y aura distinction claire dans les images d'émission P et S. Comme le montre la Figure 2A, le P émission sera vivement mettre en évidence les zones de la membrane qui sont lamelle oblique (c'est à dire les bords de l'empreinte de la cellule), tandis que l'intensité d'émission S sera à peu près uniforme sur l'empreinte de la cellule. Si une distinction claire entre P et S n'est pas apparent, alors il est possible que la cellule est faiblement collée sur le substrat ou la membrane cellulaire n'est pas en bonne santé, et la cellule n'est pas utilisée pour les expériences.
Nos études antérieures décrivant pTIRFM utilisés DII que la sonde de membrane fluorescent. Ici, nous utilisons at car il est adapté pour la double-couleur des expériences d'imagerie qui emploient GFP / pHluorin que l'autre fluorophore. On excite n'a wie Un laser 561 nm plutôt qu'à 640 nm de laser (qui est plus proche de son pic d'excitation), parce que les agents de blanchiment plus rapidement fluorophores à 640 nm. Malgré le fait que le laser 561 nm est présent dans la queue de DID spectre d'excitation publiée, la fluorescence est émise de manière efficace. Un autre avantage du laser nm 561 est qu'il excite les deux DII et ne nous permet d'utiliser la même configuration de polarisation pour les deux sondes. A noter que l'orientation du fluorophore dans la membrane aura une incidence sur l'interprétation de la topologie de membrane. Par exemple, si un fluorophore ont été orientés avec ses dipôles de transition perpendiculaire au plan de la membrane (plutôt que parallèle, ou presque parallèles, comme c'est le cas avec DII ou a fait), alors les régions de la membrane non planes seront mis en évidence par le S plus facilement plutôt que l'émission de P.
Nous avons également décrit des techniques pour l'isolement et l'électroporation des cellules chromaffines surrénales bovines. La cellule chromaffin bovine est un excellent smodèle ecretory. Il a les avantages d'être facile à maintenir en culture, en réponse à une variété de sécrétagogues, et possédant de grandes vésicules sécrétoires qui sont facilement visualisées par microscopie optique conventionnelle. Pour exprimer des protéines fluorescentes, les cellules sont électroporation en suspension avant étalement sur des boîtes de culture de collagène traitée. Dans notre expérience, l'efficacité d'expression est beaucoup plus élevé avec électroporation que soit avec Ca 2 +-phosphate ou réactifs Lipofectamine. L'inconvénient de l'électroporation est qu'il nécessite plus de cellules (comme beaucoup ne survivent pas au processus) et réactifs commerciaux coûteux. Pour des raisons qui ne sont pas claires pour nous, pas chaque membrane intègre DID. En outre, seule une fraction des cellules sur la capsule sont transfectées. Trouver des cellules qui sont transfectées et sont bien colorées avec n'ai peut être consommatrice de temps et c'est pourquoi l'optimisation des conditions pour la coloration et l'électroporation vaut bien l'effort.
En résumé, cette uneArticle décrit comment pTIRFM est mis en œuvre pour surveiller les déformations de la membrane rapides et localisées qui se produisent lors de la fusion des vésicules à cœur dense dans les cellules chromaffines bovines. Bien qu'une seule demande ne soit examinée, la technique est idéale pour l'étude d'autres processus biologiques qui impliquent des changements dans la forme de la membrane, dont l'endocytose, la cytocinèse, et la motilité cellulaire.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche est soutenue par une subvention nationale de développement scientifique (13SDG14420049) à AA de l'American Heart Association et des fonds de démarrage de la Wayne State University. Nous sommes redevables à M. Ronald W. Holz et le Dr Marie Bittner pour fournir des conseils en ce qui concerne les préparations surrénales bovines et Dr Daniel Axelrod pour l'aide à la pTIRFM mis en place et des commentaires utiles sur le manuscrit. Syt-1 pHluorin a été utilisé avec l'autorisation du Dr Gero Miesenböck (Université d'Oxford). GCAMP5G a été obtenue par Addgene. Nous remercions James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman, et Praneeth Katrapti avec l'aide à l'optimisation de différentes étapes des procédures décrites.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |