ध्रुवीकरण आधारित कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (pTIRFM) कोशिका झिल्ली गतिशीलता के वास्तविक समय का पता लगाने में सक्षम बनाता है. यह लेख विनियमित एक्सोसाइटोसिस दौरान झिल्ली remodeling के अध्ययन के लिए pTIRFM के कार्यान्वयन का वर्णन करता है. तकनीक प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से झिल्ली आकार में परिवर्तन शामिल है कि कोशिका जीव विज्ञान में अन्य प्रक्रियाओं को generalizable है.
एक्सोसाइटोसिस की गतिशीलता में उपन्यास अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, हमारे समूह ठीक पुटिका और प्लाज्मा झिल्ली के विलय के दौरान विनियमित किया जाना चाहिए कि लिपिड bilayer आकार में परिवर्तन पर केंद्रित है. ये तेजी और स्थानीय परिवर्तन लिपिड और झिल्ली वक्रता कि नियंत्रण विशेष प्रोटीन के बीच गतिशील बातचीत के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. ऐसी बातचीत का अभाव ही पुटिका संलयन के लिए विनाशकारी परिणाम हो, लेकिन झिल्ली आकार का नियंत्रण शामिल है कि अन्य सेलुलर कार्यों के एक मेजबान नहीं होता. हाल के वर्षों में, झिल्ली को आकार देने के गुणों के साथ प्रोटीन की एक संख्या की पहचान निर्धारित किया गया है. क्या लापता रहता है जब, जहां, और कैसे वे फ्यूजन और सामग्री रिहाई प्रगति के रूप में कार्य की एक योजना है.
झिल्ली remodeling सक्षम है कि आणविक घटनाओं की हमारी समझ ऐतिहासिक झिल्ली वक्रता के प्रति संवेदनशील हैं या अस्थायी समाधान Trac करने के लिए है कि विश्लेषणात्मक तरीकों की कमी के द्वारा सीमित किया गया हैतेजी से बदलाव k. PTIRFM इन मानदंडों में से दोनों को संतुष्ट करता है. हम pTIRFM घने कोर पुटिका (DCV) फ्यूजन दौरान क्रोमाफिन कोशिका झिल्ली के उन्मुखीकरण में तेजी, submicron परिवर्तन कल्पना और व्याख्या करने के लिए लागू किया गया है कि कैसे पर चर्चा की. हम उपयोग क्रोमाफिन कोशिकाओं गोजातीय अधिवृक्क ग्रंथियों से अलग कर रहे हैं. झिल्ली एक lipophilic carbocyanine डाई, 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4 chlorobenzenesulfonate के साथ दाग, या किया जाता है. एक "निर्धारित" अभिविन्यास के साथ झिल्ली विमान में intercalates था और क्षणभंगुर क्षेत्र का ध्रुवीकरण करने के लिए इसलिए संवेदनशील है. सना हुआ था कोशिका झिल्ली एक 561 एनएम लेजर (P-पीओएल, S-पीओएल) के orthogonal polarizations साथ क्रमिक रूप से उत्साहित है. एक 488 एनएम लेजर संलयन के पल पुटिका घटक और समय कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक्सोसाइटोसिस स्थानीय स्तर पर एक depolarizing KCl समाधान के साथ कोशिकाओं perfusing से शुरू हो रहा है. विश्लेषण किया कि कैसे को समझने के लिए कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ऑफ़लाइन किया जाता हैउत्सर्जन तीव्रता में परिवर्तन संलयन ताकना फैलाव से संबंधित हैं.
एक्सोसाइटोसिस के समुचित निष्पादन ठीक करवाया जा झिल्ली bilayer आकार में चरम परिवर्तन की आवश्यकता है. पिछले संलयन के लिए, दाना तहत प्लाज्मा झिल्ली की स्थानीय झुकने bilayers की बातचीत के लिए ऊर्जा अवरोध को कम करने के लिए भाग में होता है. झिल्ली के रूप में मर्ज बाद में, उच्च वक्रता के क्षेत्रों उत्पन्न कर रहे हैं और स्थिर हो जाना चाहिए. अंत में, जुड़े झिल्ली संलयन ताकना विस्तार और सामग्री जारी 1 सक्षम करने के लिए अपने प्रारंभिक आकार तुला बाहर किया जाना चाहिए. अकेले झिल्ली ऐसी नाटकीय और समन्वित परिवर्तन से गुजरना की संभावना नहीं है, क्योंकि प्रोटीन की घटनाओं में मध्यस्थता करने के लिए आवश्यक हैं. लेकिन वे कैसे संलयन की प्रक्रिया के दौरान झिल्ली टोपोलॉजी में परिवर्तन को प्रभावित करने के कार्य बहुत ज्यादा एक खुला प्रश्न बना हुआ है.
इन विट्रो मॉडल में उत्कृष्ट झिल्ली वक्रता कल्पना करने के लिए मौजूद हैं. नकारात्मक दाग EM का उपयोग करते हैं, उदाहरण के लिए, दो प्रमुख तस्करी पी के कार्यों के लिए वर्तमान आणविक मॉडल को आकार देने के लिए महत्वपूर्ण हो गया हैroteins – synaptotagmin और dynamin (समीक्षा के लिए, फेरीवाला 2 और Henshaw 3 देखें). एक्सोसाइटोसिस के अधिकांश वास्तविक समय assays सीधे वक्रता का पता नहीं लगा. इसके बजाय, वक्रता lumenal माल रिहाई 4-8 या झिल्ली क्षेत्र 9-11 में परिवर्तन के कैनेटीक्स पर रिपोर्ट कि assays से inferred है. PTIRFM झिल्ली micromorphology में परिवर्तन का सीधा, वास्तविक समय माप सक्षम द्वारा vivo में इन विट्रो अध्ययन में बीच की खाई को पुल.
PTIRFM, एक nonimaging मोड में, एक मॉडल झिल्ली 12 में शामिल NPD पीई के उन्मुखीकरण को मापने के लिए एक्सेरोल्ड और उनके सहयोगियों ने बीड़ा उठाया है. तकनीक तो DII और FM1-43 13-18 के साथ लेबल जीवित कोशिकाओं में गतिशील परिवर्तन कल्पना करने के लिए लागू किया गया था. पी ध्रुवीकरण (घटना के विमान में) और (घटना के विमान को सीधा) एस ध्रुवीकरण: pTIRFM में, दो क्षणभंगुर क्षेत्र polarizations क्रमिक रूप से एक झिल्ली एम्बेडेड जांच उत्तेजित करने के लिए उपयोग किया जाता है. इमेजिंग के लिए पहले, जांच – इस मामले में, था – संक्षेप कोशिकी माध्यम से जोड़ा जाता है और अध्ययन किया जा कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में intercalate की अनुमति दी है. झिल्ली (एक झिल्ली व्याकुल या खरोज के रूप में) coverglass को nonparallel है जहां क्षेत्रों में भी nonparallel हो जाएगा था. इसलिए, ऐसे क्षेत्रों P-पीओएल बीम से उत्तेजनीय हो जाएगा. P-पीओएल बीम कम प्रभावी ढंग से ज्यादातर coverglass समानांतर हैं कि झिल्ली क्षेत्रों में किया था उत्तेजित होगा. पिक्सेल करने वाली पिक्सेल अनुपात छवियों (पी / एस) इसलिए विशेष रूप से झिल्ली विरूपण के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला जाएगा था की अनुक्रमिक पी और एस पीओएल उत्तेजना से उत्सर्जन पर रिपोर्टिंग. सिद्धांत रूप में, पी / एस अनुपात छवियों संवेदनशील हैं कंप्यूटर सिमुलेशन 18 ने भविष्यवाणी परिवर्तन के आयाम के साथ coverglass से प्लाज्मा झिल्ली विचलन, का भी छोटे कोण करने के लिए. पी / एस छवियाँ भी coverglass सतह से फ्लोरोफोरे दूरी से स्वतंत्र हैं और स्थानीय फ्लोरोफोरेएकाग्रता. स्थानीय fluorophore एकाग्रता के बजाय पी उत्सर्जन की पिक्सेल करने वाली पिक्सेल राशि और 2 बार उत्सर्जन (पी 2 एस) पर रिपोर्टिंग छवियों द्वारा प्रदान की जाती है. पी 2 एस माप कुछ संभव है, थोड़ा है, या कोई परिवर्तन के साथ, खरोज के सटीक ज्यामिति के प्रति संवेदनशील है. इस कंप्यूटर सिमुलेशन द्वारा दिखाया जा सकता है कि एक बाद राज्य 16,18 के लिए (एक संकीर्ण गर्दन के साथ आईई) एक जल्दी से एक संलयन ताकना के मॉडल बदलाव. पी एक संकीर्ण गर्दन के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली से जुड़ी एक दूसरे से जुड़ने पुटिका के दो एस (और साथ अधिक अंतरफलक के करीब था) (एक बहुत व्यापक ताकना के साथ एक दूसरे से जुड़ने पुटिका की तुलना में, उदाहरण के लिए, अधिक से अधिक होने की भविष्यवाणी की है, जहां था) क्षणभंगुर क्षेत्र की dimmest भाग के भीतर है.
इस अनुच्छेद में, हम pTIRFM कार्यान्वित और संलयन ताकना फैलाव के दौरान होने वाले झिल्ली आकार में तेजी, स्थानीय परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है कि कैसे पर चर्चा की. केवल एक ही आवेदन में स्पष्ट रूप से दी हैscussed, तरीकों को प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से झिल्ली remodeling शामिल है कि अन्य सेल जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म को generalizable हैं.
ध्रुवीकरण आधारित TIRFM झिल्ली टोपोलॉजी में तेजी, submicroscopic परिवर्तन का पता लगाता है. तकनीक को लागू करने TIRF प्रकाशिकी जगह में पहले से ही कर रहे हैं, खासकर अगर अपेक्षाकृत सरल है. जरूरत है कि सभी एक चौथाई लहर प्लेट, दो ध्रुवीकरण क्यूब्स, और पी पी ओ एल और एस पीओएल रोशनी रास्तों को अलग करने के शटर है. मेज पर इन घटकों की सटीक स्थिति आमतौर पर उपलब्ध अंतरिक्ष से निर्धारित होता है.
झिल्ली topological जानकारी प्राप्त करने के लिए, प्रयोग किया फ्लोरोसेंट जांच एक निश्चित या ज्ञात उन्मुखीकरण के साथ intercalate चाहिए. तकनीक, इस आलेख में वर्णित के रूप में, इस तरह के FM1-43 14, भी इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में carbocyanine रंजक लेकिन अन्य रंगों का उपयोग करते हैं, मान लिया गया. झिल्ली धुंधला प्रक्रिया ही सीधा है. संवर्धित कोशिकाओं की झिल्ली विपुल लेबलिंग प्राप्त करने के लिए किया था DII / की एक छोटी मात्रा के लिए केवल एक बहुत संक्षिप्त जोखिम (कम से कम 10 सेकंड) की आवश्यकता होती है. अतिरिक्त रंग जोड़ना प्रकाश बिखरने aggreg की ओर जाता हैछवि गुणवत्ता कम जो कांच पर Ates. डाई के साथ खत्म-incubating कोशिकाओं छवि गुणवत्ता और संभवतः सेल व्यवहार्यता पर हानिकारक असर पड़ता है जो internalization डाई की ओर जाता है. एक सेल अच्छी तरह से सना हुआ है, तो पी और एस उत्सर्जन छवियों में स्पष्ट अंतर हो जाएगा. चित्रा 2A में दिखाया गया है, पी उत्सर्जन ताजा उत्सर्जन तीव्रता सेल पदचिह्न से अधिक मोटे तौर पर एक समान हो जाएगा, जबकि (सेल पदचिह्न के किनारों आईई) coverslip परोक्ष हैं कि झिल्ली के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला जाएगा. पी और एस के बीच एक स्पष्ट अंतर स्पष्ट नहीं है, तो यह सेल खराब सब्सट्रेट का पालन किया या कोशिका झिल्ली स्वस्थ नहीं है, और सेल प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाता है कि संभव है.
PTIRFM का वर्णन हमारे पिछले अध्ययनों फ्लोरोसेंट झिल्ली जांच के रूप में DII का उपयोग किया. यह अन्य फ्लोरोफोरे रूप GFP / pHluorin कि रोजगार दोहरी रंग इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयुक्त है क्योंकि यहां, हमने किया उपयोग. हम किया था वाई उत्तेजितएक 561 एनएम लेजर के बजाय (अपनी उत्तेजना शिखर के करीब है) 640 एनएम लेजर वें क्योंकि 640 एनएम पर और अधिक तेजी से फ्लोरोफोरे विरंजकों. 561 एनएम लेजर के प्रकाशित उत्तेजना स्पेक्ट्रम, प्रतिदीप्ति कुशलता से उत्सर्जित होता था की पूंछ पर है कि इस तथ्य के बावजूद. 561 एनएम लेजर का एक अन्य लाभ यह है कि यह दोनों DII उत्तेजित और दोनों जांच के लिए एक ही ध्रुवीकरण स्थापना का उपयोग करने के लिए हमें सक्षम किया है. झिल्ली में फ्लोरोफोरे के उन्मुखीकरण झिल्ली टोपोलॉजी की व्याख्या को प्रभावित करेगा कि ध्यान दें. (DII साथ या था मामला है, बल्कि समानांतर, या लगभग समानांतर से) एक fluorophore झिल्ली विमान को सीधा अपने संक्रमण द्विध्रुव साथ उन्मुख थे अगर उदाहरण के लिए, तो nonplanar झिल्ली क्षेत्रों में अधिक आसानी से एस से प्रकाश डाला बजाय होगा पी उत्सर्जन.
हम भी गोजातीय अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं के अलगाव और electroporation के लिए तकनीक का वर्णन किया है. गोजातीय क्रोमाफिन सेल एक उत्कृष्ट s हैecretory मॉडल. यह secretogogues की एक किस्म के लिए उत्तरदायी संस्कृति, में बनाए रखने के लिए आसान जा रहा है, और आसानी से पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना कर रहे हैं कि बड़े स्रावी vesicles रखने के फायदे हैं. फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, कोशिकाओं पूर्व कोलेजन इलाज कल्चर व्यंजन पर चढ़ाना को निलंबन में electroporated कर रहे हैं. हमारे अनुभव में, अभिव्यक्ति दक्षता सीए 2 + फॉस्फेट या Lipofectamine अभिकर्मकों के साथ या तो से electroporation के साथ काफी ज्यादा है. electroporation की खामी यह अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता है (कई के रूप में प्रक्रिया जीवित नहीं है) और महंगा वाणिज्यिक अभिकर्मकों है. हमारे लिए स्पष्ट नहीं कर रहे हैं कि कारणों से नहीं, हर झिल्ली था शामिल किया गया. इसके अलावा, पकवान पर कोशिकाओं का एक अंश ही ट्रांसफ़ेक्ट हैं. ट्रांसफ़ेक्ट हैं और था के साथ अच्छी तरह से दाग रहे हैं कि कोशिकाओं ढूँढना धुंधला और electroporation प्रयास के लायक है के लिए शर्तों का अनुकूलन यही वजह है कि समय लगता हो सकता है.
संक्षेप में, यह एकrticle pTIRFM गोजातीय क्रोमाफिन कोशिकाओं में घने कोर vesicles के संलयन के दौरान हो कि तेजी और स्थानीय झिल्ली विकृतियों की निगरानी के लिए लागू किया जाता है कैसे करें. केवल एक ही आवेदन पर विचार विमर्श किया जाता है, तकनीक आदर्श endocytosis, cytokinesis, और सेल गतिशीलता सहित झिल्ली आकार में परिवर्तन, शामिल है कि अन्य जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुकूल है.
The authors have nothing to disclose.
इस शोध वेन स्टेट यूनिवर्सिटी से अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन और शुरू हुआ धन से ए.ए. के लिए एक राष्ट्रीय वैज्ञानिक विकास अनुदान (13SDG14420049) द्वारा समर्थित है. हम pTIRFM सेट अप और पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के साथ सहायता के लिए गोजातीय अधिवृक्क तैयारियों और डॉ. डैनियल एक्सेरोल्ड के बारे में सलाह प्रदान करने के लिए डॉ. रोनाल्ड डब्ल्यू Holz और डॉ. मैरी Bittner के लिए आभारी हैं. Syt -1 pHluorin के साथ इस्तेमाल किया गया था डॉ. Gero Miesenbock (ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय) की अनुमति. GCAMP5G Addgene के माध्यम से प्राप्त हुई थी. हम वर्णित प्रक्रियाओं के विभिन्न चरणों के अनुकूलन पर मदद से जेम्स टी. टेलर, Tejeshwar राव, राहेल एल Aikman, और Praneeth Katrapti धन्यवाद.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |