偏光ベース全内部反射蛍光顕微鏡(pTIRFM)は、細胞膜動態のリアルタイム検出を可能にする。この記事では、調節性エキソサイトーシスの間に膜のリモデリングの研究のためpTIRFMの実装について説明します。技術は、直接的または間接的に、膜形状の変化を伴う細胞生物学における他のプロセスに一般化である。
エキソサイトーシスのダイナミクスに新たな知見を得るために、我々のグループは、正確に小胞と原形質膜の融合の間に調節されている必要があり、脂質二重層形状の変化に焦点を当てています。これらの迅速かつ局所的な変化は、脂質及び膜の曲率を制御する特殊なタンパク質間の動的な相互作用によって達成される。このような相互作用が存在しない場合にのみ、小胞融合に壊滅的な結果を持っているが、膜形状の制御を伴う他の細胞機能のホストではないでしょう。近年では、膜成形特性を有する多くのタンパク質の同一性が決定されている。何が不足して残っていることはいつ、どこで、どのように融合し、コンテンツのリリース進捗状況として機能のロードマップである。
膜のリモデリングを可能にする分子事象の理解は、歴史的に曲率を膜またはTracのに時間分解能を持っているに敏感な分析方法の不足によって制限されていた急速な変化をk個。 PTIRFMは、これらの基準の両方を満たしている。私たちは、pTIRFMが高密度コア小胞(DCV)融合時のクロム親和細胞膜の配向性が急速に、サブミクロンの変化を視覚化し、解釈するために実装されている方法について説明します。我々が使用するクロム親和性細胞は、ウシ副腎から単離される。膜は、親油性カルボシアニン色素で染色し、1,1 ' – ジオクタデシル-3,3,3'、3'-tetramethylindodicarbocyanine、4 – クロロベンゼンスルホン酸、またはDIDれる。 「固定」向きで膜面内でのインターカレーを行なったし、エバネッセント場の偏することに敏感である。染色されなかった細胞膜は、561 nmレーザー(p偏、S偏)の直交偏光で順次励起される。 488nmレーザーは、融合の瞬間ベシクル成分および時間を可視化するために使用される。エキソサイトーシスは、局所的脱分極KCl溶液で細胞を灌流によって誘発される。解析は、どうやったのかを理解するためのカスタム書かれたソフトウェアを使用してオフラインで実行されている発光強度の変化は、融合細孔拡張に関する。
エキソサイトーシスの適切な実行を正確編成されるように膜二重層形状の極端な変化を必要とします。融合の前に、顆粒の下で原形質膜の局所的な曲げは、二重層の相互作用のためのエネルギー障壁を低減するために部分的に生じる。膜は、マージ、後に、曲率の高い領域が生成され、安定化されなければならない。最後に、融合した膜は融合孔を拡大し、コンテンツのリリース1を有効にするには、彼らの初期形状から曲げられている必要があります。一人で膜はこのような劇的な協調変化を受ける可能性は低いであるため、タンパク質は、イベントを仲介するために必要である。しかし、どのように彼らが融合プロセスの間に膜トポロジーの変化に影響を与えるように作用することは非常に多くの未解決の問題のまま。
インビトロモデルにおける優れた、膜の曲率を可視化するために存在する。ネガティブ染色EMの使用は、例えば、二つの主要な人身pのアクションのために現在の分子モデルを整形するために重要であったroteins -シナプトタグミンとダイナミン(レビューのために、チャップマン2とヘンショー3を参照)。エキソサイトーシスのほとんどリアルタイムのアッセイは、直接の曲率を検出しない。その代わりに、湾曲は内腔の貨物リリース4-8または膜面積9月11日の変化の動態について報告したアッセイから推測されます。 PTIRFMは、膜の微細形態の変化の直接的なリアルタイム測定を可能にすることによってin vivoおよびin vitro試験の間のギャップを埋める。
PTIRFMは、非結像モードでは、モデル膜12内に組み込まれたNPD-PEの配向を測定するために、アクセルロッドらによって開拓された。技術は、次いで、DIIおよびFM1-43で標識された13-18生細胞の動的変化を視覚化するために適用した。 (入射面に垂直な方向)(入射面内)のp偏光とs偏光:pTIRFMでは、2つのエバネッセント場の偏光を順次膜に埋め込まれたプローブを励起するために使用されている。イメージングの前に、プローブが – この場合には、DID – 簡単に細胞外培地に添加され、研究されるべき細胞の原形質膜内にインターカレートさせる。膜は(膜フリルやインデントのように)カバーガラスに非平行である地域では、インクルードも非平行になりました。したがって、このような領域は、p偏光により励起可能であろう。 p偏光が少なく効果的に大部分がカバーガラスに平行であるメンブレン領域で行った励起する。ピクセル対ピクセル比画像(P / S)ですので、特に膜変形の領域をハイライト表示されますDIDの順次P-及びS-POL励起からの放射に関するレポート。理論的には、P / S比の画像が感受性であるコンピュータシミュレーション18によって予測の変化の振幅がカバーガラスから原形質膜偏差の小さな角度である。P / S画像はまた、カバーガラス表面からのフルオロフォアの距離に独立しており、そして地元の蛍光団濃度。ローカルフルオロフォア濃度の代わりにP放出と2回S放出(P +2 S)のピクセル対ピクセル和について報告した画像によって提供される。 P 2 S測定は、いくつかの、ほとんど、あるいは全く変化が可能で、インデントの正確な幾何学的に敏感である。これは( つまり、狭い首)の早期から、後の状態16,18への融合細孔のモデルの遷移コンピュータシミュレーションによって示すことができる。 P狭い首を経由して、細胞膜に付着し融合した小胞の2、S(と、より、インタフェースに近いDID)(はるかに広い毛穴との融合小胞のそれよりも、例えば、大きいことが予測される場合DID)エバネッセント場の最も暗い部分の中にある。
この記事では、我々はpTIRFMが実装され、融合細孔拡張中に発生する膜状の急速な、局所的な変化を研究するために利用される方法について説明します。唯一つのアプリケーションは、明示的にディですがscussed、本方法は、直接的または間接的に、膜のリモデリングが関与する他の細胞の生物学的プロセスの様々な一般化である。
偏光ベースのTIRFMは、膜トポロジーの急激な、超顕微鏡の変更を検出します。テクニックを実装すると、全反射光学系は既に実施されている場合は特に、比較的簡単である。必要とされているのは、四分の一波長板、二枚の偏光キューブ、およびp-polおよびS偏照明経路を分離するためのシャッターである。テーブルの上にこれらのコンポーネントの正確な位置は、通常、利用可能なスペースによって決定されます。
膜位相情報を得るために、使用される蛍光プローブが固定または既知の向きにインターカレートするべきである。技術は、この資料に記載されているように、例えば、FM1-43 14を使用してもよいようなカルボシアニン色素が、他の染料の使用を前提としています。膜染色手順自体は簡単です。培養された細胞は、膜のあふれんばかりのラベルを取得するためにやったDII /少量のごく短時間の曝露(10秒未満)が必要です。過剰な染料を追加すると、光散乱aggregにつながる画像品質を低下させ、ガラス上のATE。染料とオーバーインキュベート細胞は、画質およびおそらく細胞生存率に対して有害な効果を有する内在化を染色するために導く。細胞が十分に染色されている場合は、PとS放出画像内の明確な区別があるでしょう。 図2Aに示すように、Sの発光強度は、セルのフットプリントにわたってほぼ均一であるが、P発光が鮮やかに(細胞足跡すなわちエッジ)カバースリップ斜めになっている、膜の領域を強調します。 PとSとの間の明確な区別が明確でない場合、それはセルが不十分基板または細胞膜に付着している可能性がある健康的ではなく、細胞は実験のために使用されない。
pTIRFMを記述する我々の以前の研究では、蛍光膜プローブとしてDIIを利用した。それは、他のフルオロフォアとしてGFP / pHluorinを用いるデュアルカラーイメージング実験に適しているので、ここでは、DID利用する。私たちは、DID WIを励起561 nmのレーザーではなく(その励起ピークに近い)640 nmのレーザー番目の640 nmにおけるより迅速に発蛍光漂白剤のため。 561 nmのレーザー励起スペクトルを公表しているのDIDのテール上にあるという事実にもかかわらず、蛍光を効率的に放出される。 561 nmのレーザーの別の利点は、DII、両方のプローブについて同じ偏光設定を使用するように問い合わせを可能にするDIDの両方を励起することである。膜内の蛍光体の向きが膜トポロジーの解釈に影響することに注意してください。 (DIIまたはなかった場合のように、むしろ平行、またはほぼ平行ではない)のフルオロフォアが膜面に垂直な遷移双極子配向した場合、次に、非平面の膜領域がより容易にSで強調表示はなくなりP放出。
また、ウシ副腎髄質細胞の単離およびエレクトロポレーションするための技術を記載している。牛クロム親和細胞は、優れたSですecretoryモデル。それは、文化の中で維持するために、分泌促進物質の様々に反応が容易であること、および容易に従来の光学顕微鏡を用いて可視化された大規模な分泌小胞を有するという利点があります。蛍光タンパク質を発現するために、細胞の前処理されたコラーゲン培養皿上にプレーティングした懸濁液にエレクトロポレーションする。我々の経験では、発現効率は、Ca 2 + -リン酸またはトランスフェクション試薬のどちらかよりもエレクトロポレーションとはるかに高い。エレクトロポレーションの欠点は、より多くの細胞(多くのようなプロセスを生存しない)と、高価な市販の試薬を必要とすることである。私たちには不明である理由のために、必ずしもすべての膜がDIDが組み込まれています。また、皿上の細胞の一部のみをトランスフェクトする。トランスフェクトされ、DIDとよく染色された細胞を見つけることは染色およびエレクトロポレーションは努力の価値があるための条件を最適化する理由である、時間がかかる場合があります。
要約すると、このArticleはpTIRFM、ウシクロマフィン細胞での高密度コア小胞の融合中に発生し、迅速かつ局所的な膜の変形を監視するために実装されている方法を説明します。つのアプリケーションのみがdiscussed Althoughさ、テクニックは理想的エンドサイトーシス分裂及び細胞運動含む膜状に変化を伴う他の生体プロセスの研究に適する。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、ウェイン州立大学で米国心臓協会と起動ファンドからAAに国立科学開発グラント(13SDG14420049)でサポートされています。我々の原稿にpTIRFMのセットアップと有益なコメントの支援のためにウシ副腎準備に関するアドバイスを提供し、博士ダニエル·アクセルロッド博士ロナルド·W·ホルツ博士メアリービットナーにお世話になっている。SYT-1 pHluorinで使用されました博士下呂Miesenbock(オックスフォード大学)の許可。 GCAMP5GはAddgeneを通して得られた。我々は、説明した手順の様々なステップを最適化する上で助けを借りて、ジェームズ·T.テイラー、Tejeshwarラオ、レイチェルL.·エイクマン、およびPraneeth Katraptiに感謝します。
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |