Summary
Denne protokol beskriver ekstracellulær registrering af action potentielle reaktioner affyret af labellar smag neuroner i Drosophila.
Abstract
Den perifere smag reaktion insekter kan kraftigt undersøgt med elektrofysiologiske teknikker. Den her beskrevne metode tillader forskeren at måle gustatory svar direkte og kvantitativt, hvilket afspejler den sanseindtryk at insektet nervesystem modtager fra smag stimuli i omgivelserne. Denne protokol beskriver alle vigtige trin i udførelsen af denne teknik. De kritiske trin i at samle en elektrofysiologi rig, såsom udvælgelse af nødvendigt udstyr og et passende miljø til optagelse, der er afgrænset. Vi beskriver også, hvordan man kan forberede sig til optagelse ved at foretage relevante reference-og registreringselektroder, og tastant løsninger. Vi beskriver i detaljer den anvendte metode til at forberede insekt ved indsættelse af et glas referenceelektrode i fluen for at immobilisere snabel. Vi viser spor af de elektriske impulser, som opvarmes med smag neuroner som reaktion på en sukker-og en bitter forbindelse. Aspekter ved protokollen er technically udfordrende og vi inkluderer en omfattende beskrivelse af nogle fælles tekniske udfordringer, der kan opstå, såsom manglende signal eller overdreven støj i systemet, og mulige løsninger. Teknikken har begrænsninger, såsom manglende evne til at levere tidsligt komplekse stimuli, observere baggrund fyring umiddelbart før stimulus levering, eller brug vanduopløselige smag forbindelser bekvemt. På trods af disse begrænsninger, denne teknik (herunder mindre variationer der henvises til i protokollen) er en standard, bredt accepteret procedure for registrering af Drosophila neuronale reaktioner at smage forbindelser.
Introduction
Smagssansen giver et insekt for at opdage en bred vifte af opløselige kemikalier og spiller en vigtig rolle for accepten af en nærende substans, eller afvisning af et farligt eller giftigt én. Taste menes også at spille en rolle i mate udvælgelse, gennem påvisning af feromoner 1-5. Disse vigtige og forskelligartede funktioner har gjort det insekt smag systemet en overbevisende mål for undersøgelse af, hvordan sansesystemer oversætte miljømæssige signaler i relevante adfærdsmæssige udgange.
Den primære enhed i Drosophila melanogaster smag system er smagen hår, eller sensillum. Molekyler indtaste sensillum via en pore på spidsen 2,6. Sensilla findes på labellum, benene, vingen margen og svælget 6.. På labellum, er antallet og placeringen af sensilla stereotype. Der er tre morfologiske klasser af sensilla baseret på længde: Den lange (L), mellemprodukt (I) og korte (S ) Sensilla 7,8. Hver sensillum indeholder enten to (I-type) eller fire (L-og S-type) gustatory receptor neuroner (GRNs) 9. Forskellige GRNs reagere på forskellige kategorier af smags stimuli: bitter, sukker, salt og osmolaritet 7,10 og udtrykke forskellige delgrupper i gustatoriske receptorer 8,11-13. Kun jeg og S-typen sensilla indeholde bitter-reagerende GRNs 8,10. Den GRNs projektet til subesophageal ganglion (SOG) og deres aktivering af smag molekyler videresendes til den højere centralnervesystemet til dekodning, hvilket resulterer i en adfærdsmæssig reaktion 6. Det relativt lille antal neuroner og modtagelighed for molekylære og adfærdsmæssige analyse gør Drosophila smag systemet en fremragende model til undersøgelse af gustatory i almindelighed. Den relative lethed, hvormed systemet kan manipuleres via genetisk mutation eller GAL4-UAS ekspressionssystem fungerer også som et værdifuldt redskab 14,15.
NDHOLDET "> Fordi disse sensilla stikker ud fra overfladen af labellum, de gør glimrende mål for elektrofysiologi. kan overvåges affyring af GRNs hjælp ekstracellulære optagelse. Historisk set sidevæg optagelse metode, som bruger et glas elektrode indsat i sensillum at optage neuronal aktivitet, 26 er blevet anvendt. denne metode er imidlertid teknisk udfordrende at udføre, og det er vanskeligt at optage langt fra hvert præparat. Spidsen-optagelse metode, der måler responsen af neuroner med en elektrode, samtidig leverer en tastant, da er blevet den foretrukne metode 9,16. Det er blevet anvendt til at undersøge smagen system Drosophila melanogaster 8,10,17,18 samt en række andre insektarter 19-23. Det har blevet lettet betydeligt af udviklingen af tastePROBE forstærker, der overvandt en af de store ulemper ved tip-optagelse metode ved at kompensere forden store potentielle forskel mellem reference elektrode og insekt sensillum, tillade GRN virkningspotentialer skal registreres uden overdreven forstærkning eller filtrering 24. En anden vigtig udvikling var brugen af tricholine citrat som optagelsen elektrolyt 25. TCC undertrykker svar fra osmolariteten-følsomme GRN og stimulerer ikke salt-følsomme GRN, hvilket gør svarene genereret af bitter og sukker tastants meget lettere at analysere 25.Her beskriver vi, hvordan spids indspilning af Drosophila labellar sensilla øjeblikket udføres i Carlson laboratoriet. Denne protokol vil forklare, hvordan man etablerer en passende elektrofysiologi rig, hvordan man forbereder fluen, og hvordan man udfører smag optagelser. Vi præsenterer også nogle repræsentative data opnået ved at optage fra delmængder af Drosophila sensilla, samt nogle almindelige problemer og mulige løsninger, der kan opstå ved brug af denneteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol overholder alle retningslinjerne i Yale University dyrepleje.
1.. Reagenser og udstyr Forberedelse
- Optagelse udstyr setup (figur 1A).
- Vælg en plads til rig setup, der er fri for store udsving i temperatur og fugtighed, og også isoleret fra kilder til elektrisk og mekanisk støj, såsom køleskabe og centrifuger.
Figur 1. (A) Oversigt over optagelse rig setup. Stereomikroskop (a) er monteret på vibrationsdæmpende platform (b). Referenceelektrode holder (c) er monteret på platform overfor hovedtrin (d) via mikromanipulatorer. En stikkontakt plastrør (e) leverer befugtet luftstrøm rettet mod forberedelse flue er også monteret på than platform. Hovedtrin er forbundet til forstærkeren (f), som er forbundet til det digitale system erhvervelse (DAS) (g), som er forbundet til en pc (h). (B) Konfiguration af elektroder og udløbsrør:. Referenceelektrode til venstre, optagelse elektrode på højre og luftstrøm udløbsrør rettet mod flue forberedelse Klik her for at se større billede. - Mount stereomikroskop til centrum af anti-vibration bord eller platform.
- Fastgør mikromanipulatorer til fremstilling referenceelektrode / insekt-og hovedtrin / optagelse elektrode til venstre og højre af mikroskopet, henholdsvis anvendelse af magnetiske stande.
- Mount outlet plastrør i et tredje mikromanipulator på bagsiden af mikroskopet, orienteret således, at røret åbning peger mod placeringen af flue prep (se figur 1B).
- Brug af fleksibel plastslange påtach stikkontakt plastrør termokande delvist fyldt med vand. Tilslut et lille akvarium pumpe at boble luft gennem vand i flasken, hvilket genererer en fugtig luftstrøm gennem udløbet plastrør mod flue.
- Mount fiberoptisk lyskilde off vibration bordet, orientere udgangene til at belyse forberedelse ved at reflektere lys via et stykke hvidt papir kortet direkte under forberedelse. Sørg for, at lyskilden ikke hviler på bordet. Bemærk: fordelen ved reflekterende lyskilden på et papir disken er dobbelt: det forbedrer kontrasten, hvilket gør sensilla nemmere at visualisere, og det forhindrer opvarmning af præparatet, som ville resultere i direkte lys.
- Sæt tastePROBE forstærker i digitale dataopsamlings-system (DAS), og DAS i en personlig computer i henhold til leverandørens manual. Sæt fodpedal trigger i og arrangere under arbejdsområde. Bemærk: Elektrisk isolerede stikkontakter for forstærkeren og DAS er meget ønskeligtstand.
- Elektrisk formalet mikroskop, mikromanipulatorer, og lyskilden ved at forbinde metalkomponenter til tabel ved hjælp af krokodillenæb og længder af isolerede elektriske ledninger og el-tape. Elektrisk slebet metal-platform ved at forbinde til at opbygge jorden eller DAS, som er jordforbundet via strømforsyningen stik.
- Installeres passende erhvervelse software til DAS af valg på den personlige computer. Bemærk: Sørg for, at de digitale erhvervelse driverne er kompatible med operativsystemet på pc'en.
- Konfigurer software forstærkning (10-100x), signal-filtrering (typisk et Bessel båndpasfilter indstilles fra 100 Hz-3, 000 Hz), og prøvetagning sats (mindst 10 kHz). Bemærk: Signal amplituder fra smagsmæssige neuroner er typisk i 0,5-2 mV-område, så skærmen skala er indstillet til at lette visualisering. Bemærk: 100 Hz filter hjælper med at udelukke uvedkommende elektrisk støj, men det ændrer formen på pigge og kan gøre avanceret spike sortering more udfordrende. Alternativt kan en 1 Hz-filtret anvendes.
- Eventuelt kan et Faradays bur sættes op omkring hele rystebordet. Men små ark af aluminiumsfolie er normalt tilstrækkelig til at reducere støj, der genereres af det eksterne miljø eller investigator.
- Vælg en plads til rig setup, der er fri for store udsving i temperatur og fugtighed, og også isoleret fra kilder til elektrisk og mekanisk støj, såsom køleskabe og centrifuger.
- Glaselektroden Forberedelse
Figur 2. Reference-og registreringselektroder. Fotografi under forstørrelse af glaskapillarer trukket ind referenceelektrode, med (A) og uden (B) spids brudt, og elektrode (C). White bar repræsenterer 2 mm. Klik her for at se større billede.- Træk referenceelektrode fra en glaskapillar anvendelse af en pipette aftrækker instrument. Bemærk: De præcise indstillinger af pipette aftrækker program vil variere fra instrument til instrument. Prøv at opnå en meget lang gradvis tilspidsning. Porestørrelse på spidsen er ikke afgørende, fordi spidsen vil blive brudt før forberedelse flue (figur 2A og 2B), men sørg for, at diameteren af den koniske længde af elektroden hverken er for tynd, som ikke vil give mulighed for tilstrækkelig immobilisering af labellum, heller ikke for stor, hvilket kan beskadige smagssansen neuroner eller briste spytkirtlerne.
- Træk optagelse elektrode fra en borosilikatglas kapillar med filamenter ved hjælp af en pipette aftrækker instrument. Prøv at opnå en tilspidsning, der er mere overfladisk end den henvisningen elektrode, og en pore diameter på ca 10-15 m (figur 2C) 28.
- Tastant løsninger forberedelse
- Brug Beadle-Ephrussi Ringer løsningertion (B & E) som reference elektrode elektrolyt. For at gøre en liter B & E, opløses 7,5 g NaCl, 0,35 g KCI, og 0.279 g CaCl2 ∙ 2H 2 O i en liter ultrarent vand. Opbevar mindre alikvoter ved -20 ° C.
- Brug 30 mM tricholine citratopløsning (TCC), da optagelsen elektrode elektrolyt og solvens til tastant løsninger 25, hvis bitre eller sukker GRN reaktioner skal måles. Alternativt kan 1-3 mM kaliumchlorid-opløsning anvendes, hvis svarene fra vand celle skal måles.
- For at gøre tastant løsninger, vejer passende mængde tastant i pulverform og tilføje til TCC til at foretage en indledende bestand koncentration. Brug dette til at gøre seriefortyndinger fra denne indledende lager for at give den ønskede koncentration til test. Bemærk: Hvis tastants ikke er letopløselige i vand, et andet opløsningsmiddel, såsom ethanol, kan bruges til at lave indledende stamkoncentration. En passende kontrol løsning TCC og solvens uden tastantskal anvendes i dette tilfælde.
- Store portioner lang sigt ved -20 ° C. Opbevar en arbejdsdag alikvot af en tastant opløsning ved 4 ° C til optagelse i op til en uge afhængigt af kemiske egenskaber tastant.
2.. Drosophila Fremstilling
Figur 3.. Udarbejdelse af flue til optagelse. (A) Indsættelse stilling referenceelektrode i dorsal thorax af flue. Den hvide pil angiver referenceelektroden. (B) Intermediate stilling referenceelektrode: avancerede gennem hals og hoved, snabel endnu ikke forlænget. (C, D) Flyv med henvisning elektrode i den endelige position med spidsen af elektroden inde labellum og snabelfuldt udbygget. Klik her for at se større billede.
- Saml nyligt eclosed fluer til optagelse fra velholdte insektnet kulturer, dyrket under temperatur-og fugtigheds-kontrollerede betingelser, og alder dem 5-10 dage i friske kultur hætteglas før optagelse.
- Chill mikroskop plade på is i 15-30 min før forberedelse flue.
- Opfyldning glas referenceelektrode med B & E opløsning under anvendelse af en lang, tynd plastik kanyle med en diameter på 0,5 mm, såsom en spinal kanyle og 1 ml sprøjte og bankes forsigtigt eventuelle bobler. Break lille mængde af tip fra at bruge pincet og bruge kapillarvirkning at trække alle resterende bobler med en serviet, observere under dissektionsmikroskop.
- Slide B & E-fyldte referenceelektrode på wire referenceelektrode indehaver af, pas på ikke at indføre luftbobler.
- Aspirer flyve ind i en P200 pipettespids, ved hjælp af flyve aspirator byggetfra slanger, mesh, og pipettespids, 29 plads i is spand og chill i 30-60 sek.
- Fjern mikroskop plade fra is, tør al fugt, og position under mikroskop. Bank forsigtigt på flyve ud af pipettespidsen på mikroskop plade.
Bemærk: fluen bør være tilstrækkeligt immobiliseret at manipulere nemt. - Under lav forstørrelse, forsigtigt fjerne forbenene med en tang, mens du holder thorax stabil med det andet par pincet. Placer flue på dens ventrale side, bryst opad. Bemærk: Der skal altid være omhyggelig med at undgå at berøre labellum med pincet på alle tidspunkter i løbet af forberedelsesprocessen for at minimere mekanisk skade.
- Mens du holder fluen på plads med et par pincet, indsæt henvisning elektrode på midterlinjen af bageste dorsale brystkassen. En foreslået vinkel indgang er cirka femogfyrre grader i retning af hovedet (figur 3A).
- Fastgør henvisningen electrode holder med modellervoks sådan at fluen er synlig under mikroskop ved stor forstørrelse. Manøvre og vinkel glaselektroden gennem hals og hoved, ved at skubbe fluen mod henvisningen elektrode holder den bruger to par pincet. Bemærk: Arbejde hurtigt, men uden problemer, det er lettere at udføre dette trin, mens fluen stadig er immobiliseret fra kulden (figur 3B).
- Forsigtigt udvide snabel med et par tænger, mens den glider fluen længere nede reference glaselektrode, indtil spidsen af elektroden er inde i labellum og proboscis er fuldt udvidet (figur 3C og 3D). Bemærk: Pas på ikke at punktere enhver del af snabel væv eller udspile kanten af labellum med reference elektrode, da dette kan beskadige den flue og / eller smag neuroner og påvirker optagekvalitet.
3. Optagelse fra Labellar sensilla
Figur 4.. Optagelse fra flue. (A) labellum forberedelse flue på venstre med optagelse elektrode linje for kontakt på højre, under stor forstørrelse. (B) optagelse elektrode og en enkelt sensillum på labellum i kontakt under stor forstørrelse. Klik her for at se større billede.
- Altid jorde dig selv ved at røre ved metal overflade af anti-vibration bord eller platform, før du rører noget udstyr under optagelse processen! Bemærk: Det er meget vigtigt ikke at afgive en statisk ladning til hovedtrin som kan beskadige kredsløb.
- Sikker henvisning elektrode holder til mikromanipulator monteret på luft bord Recording rig. Placer en lap af labellum i mikroskop synsfelt, under høj forstørrelse (typisk mindst 140X), og i overensstemmelse med fugtig luftstrøm.
- Tænd befugtet luftstrøm, computer, DAS, og forstærker. Åben erhvervelse software.
- Skyl og fyld glas optagelse elektrode med ønsket tastant.
- Skyl glas elektrode med ultrarent vand ved hjælp af en sprøjte og plastrør 28 til at trække små mængder vand gennem røret mindst ti gange.
- Skyl elektrode med tastant mindst fem gange. Fyld optagelse elektrode cirka en tredjedel til halvvejs fuld med tastant og fjerne fra slangen. Hvis der er luftbobler, skal du trykke for at frigive eller blot genopfylde elektroden.
- Skub elektrode på sølvtråd af hovedtrin hurtigt og smidigt, således ikke at indføre luftbobler.
- Stimuler enkelt sensillum med tastant fyldt optagelse elektrode.
- Brug micromanipulator at bringe optagelsen elektrode linje med sensillum af interesse.
- Tryk fodpedal til at udløse dataopsamling af forstærkeren.
- Fremkøring elektrode med den fine kontrolknap af mikromanipulator forsigtigt, indtil det kommer i kontakt med spidsen af sensillum og optagelsen begynder.
- Fjern elektroden efter 1-2 sek.
- Gentag trin 3.5 med andre sensilla, hvis det ønskes. Bemærk: Vent mindst 1 minut i mellem præsentationer til det samme sensillum. Ved optagelse med en enkelt tastant i en længere periode, kan tastant løsning tørre ud og løsningen i spidsen kan blive mere koncentreret. Dette kan afhjælpes ved forsigtigt at kontakte spidsen af glas-elektrode med glat papir for at fjerne en lille mængde væske ved kapillarvirkning.
- For at optage svar til en anden tastant, skyl og belastning optagelse elektrode med ny tastant og gentag trin 3.4. Bemærk: Grundigt skylle elektroden mellem tastants er absolutely afgørende at undgå krydskontaminering.
- Gem datafiler jævne med at identificere oplysninger, såsom dato, genotype og tastants. Bemærk: Det er vigtigt at holde et skriftligt referat af den tastant og sensillum identiteten af hver præsentation under optagelse session for dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5A viser responset af en L sensillum til sukker, saccharose. Det samme sensillum reagerer ikke på en bitter stof, berberine. 5B viser, at en I typen sensillum, som indeholder en bitter lydhør neuron, viser større amplitude spidser i respons på berberine, og mindre amplitude spidser i respons på saccharose. L sensilla vise en minimal baggrund reaktion på solvent kontrol, TCC, mens jeg sensilla vise næsten ingen respons på TCC (figur 5). For mere information om salt og vand reaktioner labellar GRNs henvises til Hiroi 10.
Figur 5.. Repræsentative spor af vildtype Drosophila labellar reaktioner (A) L sensillu m respons på 100 mM saccharose (SUC), 1 mM berberine (BER), og 30 mM TCC. (B) Jeg sensillar respons på SUC, BER, og TCC. Pilespidsen viser kontakten artefakt, der opstår ved begyndelsen af hver optagelse. Klik her for at se større billede.
Figur 6.. Repræsentative suboptimale elektrofysiologiske resultater. (A) fuldstændig mangel på signal (B) 50/60 Hz "støj" (C) stokastisk støj (D) mechanosensory neuron fyring alene (E) bitter GRN (åbne trekanter) og mechanosensory neuron ( fyldte trekanter) både fyring./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Labellar sensilla varierer i den lette optagelse på grund af forskelle i morfologi og anatomiske organisation. Nogle gange kan en sensillum ikke reagerer på nogen tastants, endda en, der er kendt for at fremkalde en positiv reaktion. Den hyppighed, hvormed dette sker, varierer afhængigt af sensillum type. L sensilla er mest konsekvent lydhøre og er relativt nemt at få adgang på grund af deres længde. Generelt S sensilla konsekvent lydhør, men deres korte længde og placering på labellum god kontakt udfordrende. Jeg sensilla kan tilgås lettere, afhængig af vinklen af præparatet, men de er mere hyppigt reagerer. På en given flue præparat, kan en større del af jeg sensilla være afvisende end L eller S sensilla. Genetiske baggrund kan påvirke konsistensen af smag reaktioner så godt. For eksempel kan nogle transgene fluer vist mindre konsistente responser end vildtype, formentlig fordi transgenerne påvirker general sundhed af fluen. Vi har observeret, at w - mutant fluer er særligt udfordrende at optage fra.
En almindelig teknisk problem er mangel på signal, dvs ingen pigge observeres (figur 6A). Først, nogle gange en bestemt sensillum kan være afvisende, mens andre af samme klasse på samme flue kan reagere. For det andet kan der være en luftboble i optagelsen elektrode eller referenceelektroden. Hvis der er mistanke om optagelse elektrode, kan dette fastsættes ved blot at fjerne og genpåfyldning glaselektroden, trykke blidt og inspektion under forstørrelse at sikre, at ingen bobler. Hvis der er mistanke reference elektrode til at indeholde en luftboble, genskabe prep med en ny flue er den nemmeste måde at løse dette problem. For det tredje, undertiden ledningerne transporterer det elektriske signal måske ikke tilsluttet korrekt. For det fjerde, lejlighedsvis spænding signal, der modtages, kan være enten højere eller lavere endområdet forstærkeren kan måle. Hvis du bruger tastePROBE forstærker, check for at se, hvis enten klippet op eller klip ned indikatoren er tændt. Hvis klippet op indikatoren er tændt, ofte fjerne og genopfyldning reference glaselektrode, samtidig med, at fylde ikke mere end halvvejs og udslette ned udenfor for at fjerne fugt, vil løse problemet. Fugt på ydersiden af glaselektroden kan gøre en elektrisk forbindelse mellem metal tilfældet af elektroden og tråden, og sender signalet uden for rækkevidde af forstærkeren. Hvis det ikke lykkes at løse problemet, eller klippet ned-indikator er tændt, overveje forslag i følgende afsnit til bekæmpelse af elektrisk støj i systemet. Femte, undertiden en flue kan dø under forberedelse eller på anden måde ikke reagerer på trods af forberedelse sunde udseende. Vækstbetingelser, såsom fugtighed, temperatur, alder, fødevarekvalitet og mikrobiologi, samt en mindre sunde genetisk baggrund kan bidrage til en højereandel af "ikke-reagerende" fluer. Endelig sjældent kan et stykke udstyr være nonfunctional. Hvis signalet er konsekvent ikke bliver nået, og alle andre muligheder er udtømt, kan det være nødvendigt at undersøge funktionaliteten af hvert stykke udstyr: hovedtrin, forstærker, og digitizer. Den nemmeste måde at gøre dette på er at erstatte et stykke udstyr med en anden fra en rig, der er kendt for at være funktionel. Hvis kun en Riggen er til stede i et laboratorium, kan et signal generator bruges til at teste funktionaliteten af elektroniske komponenter.
Et andet fælles teknisk problem er, at "støj", som er en observeret signal, der ikke synes at repræsentere neuronale virkningspotentialer fyret som reaktion på en gustatory stimulus (6B-E). For det første kan signalet resultere fra 50/60 Hz elektrisk støj fra kontrolapparatet eller andet udstyr i nærheden (fig. 6B). Med ingen flue på henvisningen elektrode, direktely forbinde optagelse og reference elektroder gennem en dråbe Ringers opløsning og indtast passthrough funktionen på forstærkeren ved at trykke på op-knappen. Hvis støj kan observeres på passthrough signal, det sandsynligvis betyder, at støjen er ekstern i forhold til forberedelse flyve. Sørg for, at alt riggen udstyret er korrekt jordet, og at tin folie skjolde er på plads. Prøve at frakoble udstyr i nærheden for at se, om støjen elimineres eller skjold yderligere komponenter. For det andet kan der forekomme støj stokastiske (figur 6C). I dette tilfælde bør de skridt, der er beskrevet for 50/60 Hz støj stadig blive gennemført. Derudover, så prøv at trække stikket ud eller udskifte forskellige komponenter i kontrolapparatet, især hovedtrin og / eller forstærker. Hvis der ikke observeres støj, når elektroderne er direkte forbundet, er kilden sandsynligvis fluen selve produktet. Det er normalt enkleste at udarbejde en ny flue til optagelse, tage sig for at minimere skader på fluen. Tredje aktiveringaf mechanosensory neuron indeholdt i sensillum (figur 6D og 6E), kan overholdes. Den mechanosensory neuron kan aktiveres, hvis den sensillum afbøjes eller bøjes ved anvendelsen af optagelsen elektrode, eller stødte under kontakt. Piggene er normalt skelnes fra chemosensory spikes ved deres uregelmæssige mønster, der normalt vises koordineret med den mekaniske forstyrrelser, ikke anvendelsen af en gustatory stimulus. Mechanosensory fyring kan minimeres ved at justere optagelsen elektrode med sensillum og fremme blidt kun for så vidt som det er nødvendigt at komme i kontakt med spidsen af sensillum. For det fjerde kan stokastisk spike "sprængfyldt" skal overholdes synes dette ligner neuronfyring, men er af høj frekvens og amplitude, ikke koordineret reaktion på en stimulus. Dette skyldes sædvanligvis flue prep selv, ikke fra det udstyr, og kan skyldes en nerve forstyrret af referenceelektroden. </ P>
Et tredje fælles teknisk problem er, at præparatet er mobil, hvilket får labellum til at bevæge sig, hvilket gør forbindelse med en sensillum vanskelig. Først kan præparatet flue være ustabil. Kontroller, at henvisningen elektrode er placeret korrekt, og juster om nødvendigt. For det andet kan henvisningen elektrode være for tynd i spidsen at holde snabel og labellum immobile. Prøv at afbryde en længere mængde af tip, før udarbejdelsen af fluen. Hvis dette ikke er tilstrækkeligt, genjustere pipette puller efter behov for at ændre formen reference elektrode, således at tilspidsningen er mere gradvis, og diameteren er en let øget. For det tredje kan flyve være usædvanlig aktiv. Remake præparatet med en ny flue.
For generel elektrofysiologi information og mere fejlfinding vejledning henvises til Axon Guide 30..
Der er et par begrænsninger for tip-optagelse metode, der er skitseret i denne publication. En begrænsning er, at tastant skal være vandopløselig, da det er fremsat i elektrode sammen med elektrolytten. Dette øger vanskeligheden ved optagelse med kulbrinte-forbindelser, selvom brugen af et opløsningsmiddel som DMSO har gjort nogle optagelse med feromoner mulige 4. Alternative metoder er at bruge en skærpet wolframsvejseelektrode at udføre optagelser fra soklen bunden af sensillum, eller brug en glaselektrode at udføre optagelser fra sidevæggen af sensillum, både hvilken tastant leveres uafhængigt af elektrode 26,27. Men disse teknikker er udfordrende og side-væg optagelser er mere skadelige for smagen organ. En anden begrænsning er den mængde tid, der kræves for at udveksle de tastant løsning (Protokol trin 3.3), hvilket reducerer gennemløb, og begrænser anvendelsen af komplicerede stimulus paradigmer ofte ses i olfaktoriske optagelser. Gustatory receptor neuroner udstille nogle variabiliteti amplitude der er afhængig af spike frekvens. Denne funktion kan komplicere vurderingen af neuronal identitet og gøre avanceret spike sortering sværere 25,31-33. Desuden, på grund af arten af spidsen optagelse metode kan ikke optage den basale fyring umiddelbart før leveringen af en stimulus, som er almindeligt gjort i olfaktoriske optagelser. På trods af disse ulemper, er tip-optagelse metode med succes blevet brugt til at belyse mange af de principper for smag kodning i Drosophila og andre arter 8,10,17,19,21-23.
Fluen forberedelse teknik skitseret her er blot en mulig tilgang. I denne fremstillingsmetode proboscis er fikseret i en udstrakt stilling for at lette kontakt mellem elektrode med sensillum af interesse, og referenceelektroden er indsat i dyret. Andre fremstillingsmetoder omfatter montering af dyret til en kugle af modellervoks og brugen af tynde strimler aftape til at fastgøre Snabel 34. Faktisk så længe de grundlæggende parametre for væv stabilisering og reference elektrode placering er opfyldt, sensilla andre steder eller fra forskellige arter kan optages fra på samme måde. For eksempel kan ben sensilla optages fra, ved fastsættelse af kroppen af en flue på en Sylgard-belagt objektglas med fine insekt pins, splaying benene ud over kanten af glasset lidt 35. Det er muligt at afgive farmakologiske midler til sensilla via elektrode til at undersøge signaltransduktion i smagsmæssige receptor neuroner. Det er simpelthen en opgave for eksperimenter for at afgøre, hvilken metode fungerer bedst for det ønskede resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en NRSA predoctoral tilskud 1F31DC012985 (til RD) og NIH tilskud til JC
Vi vil gerne takke Dr. Linnea Weiss for nyttige kommentarer til manuskriptet, Dr. Ryan Joseph for hjælp kompilering figurer og Dr. Frederic Marion-Poll for hjælpsomme teknisk rådgivning. Vi vil også gerne anerkende de nyttige kommentarer fra fire anmeldere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand |
| Antivibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5 mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1 cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10-40X magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1 ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10 ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
References
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. an Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Marion-Poll Lab Website. , Available from: http://taste.versailles.inra.fr/fred (2013).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
