Summary
Förekomsten av högrisk-HPV i huvud och hals tumörvävnad är förknippad med gynnsamma resultat. Den nyutvecklade RNA in situ hybridisering teknik som kallas RNAscope möjliggör direkt visualisering av HPV E6/E7 mRNA i FFPE vävnadssnitt.
Abstract
Den "gyllene standard" för onkogena HPV-detektion är demonstration av transkriptionellt aktiva högrisk-HPV i tumörvävnad. Men upptäckt av E6/E7 mRNA genom kvantitativ omvänd transkription polymeraskedjereaktion (QRT-PCR) kräver RNA-extraktion som förstör tumörvävnad sammanhang avgörande för morfologisk korrelation och har varit svår att antas i klinisk vardag. Vår nyutvecklade RNA in situ hybridisering teknik, RNAscope, medger direkt visualisering av RNA i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnader med enda molekyl känslighet och enda cell upplösning, vilket möjliggör mycket känslig och specifik in situ-analys av varje RNA biomarkör i rutinmässiga kliniska prover. Den RNAscope HPV-analysen var utformad för att upptäcka E6/E7 mRNA av sju högrisk-HPV-genotyper (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 och 58) med hjälp av en pool av genotyp-specifika prober. Det har visat utmärkt känslighetoch specificitet mot den nuvarande "gyllene standard" metod för att upptäcka E6/E7 mRNA genom QRT-PCR. HPV-status bestäms av RNAscope är starkt prognostisk av kliniskt resultat i svalg cancerpatienter.
Introduction
Högrisk humant papillomvirus (HR-HPV) infektion utgör cirka 5% av all cancer i världen 1. Förekomsten av HPV-associerad orofaryngeal cancer har ökat under de senaste decennierna, särskilt bland män. HPV-positiv orofaryngeal skivepitelcancer (OPSCC) kommer sannolikt att utgöra en majoritet av alla huvud-halscancer i USA under de kommande 20 åren 2. Orofaryngeal skivepitelcancer som orsakas av HPV är förknippade med god överlevnad och tumör HPV-status är en stark och oberoende prognostisk faktor för överlevnad 3.
Bevis för transkriptionsaktivering av de virala onkogener E6 och E7 anses vara den gyllene standarden för förekomsten av kliniskt relevanta HPV-4. Dock är detektion av E6/E7 mRNA från färsk tumörvävnad med RT-PCR-teknik inte praktiskt i rutinmässig klinisk praxis och har begränsats till forskningslaboratorier. Nyligen, vi have utvecklat en ny RNA ISH teknik som kallas RNAscope, vilket gör att multiplex detektion i enskilda celler med enkel RNA-molekyl känslighet i formalinfixerad paraffininbäddade vävnadsprover (FFPE) 5-10. Vi gav tre rader av bevis för enda molekyl upptäckt 5. För det första, det RNAscope sonden design och signalamplifieringssystem tillåten upptäckt av enstaka exemplar HER2 iska DNA-mål i HeLa-och SK-BR-3-cellinjer. För det andra, när de jämförs med HER2-genomiska DNA-signaler, fördelningen av de fluorescerande intensiteter av HER2-mRNA-signal prickar i HeLa-celler som var i överensstämmelse med en molekyl per punkt. För det tredje, antalet HER2 mRNA signal punkter per cell matchas noga HER2 mRNA kopieantal uppskattades av en lösning baserad kvantifiering analys, ytterligare stöder enda molekyl upptäckt. Dessutom motfärgning av kärnor med DAPI i fluorescensmikroskopi eller med hematoxylin i ljusfält mikroskopi tillåter visualisering av individuella kärnor, WHich i sin tur möjliggör detektion och kvantifiering av RNA-mål på enkelcellbasis 10. Förmågan att analysera genuttryck på plats i rutinmässiga kliniska prover gör RNAscope en lovande plattform för diagnostisk patologi, speciellt de FFPE vävnadssektionsbaserade analyser 10,11. Vi har utvecklat ett RNAscope-baserad HPV-analys för att detektera E6/E7 mRNA av sju högrisk HPV-genotyper (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 och 58) med hjälp av en pool av genotyp-specifika prober. Våra senare studier i OPSCC har visat att RNAscope HPV-analysen är mycket känslig och specifik för att bestämma HPV-status på FFPE vävnader 12-17, och också informerar prognos i OPSCC 12,16.
Principen för RNAscope teknologi har tidigare beskrivits 5. Här beskriver vi den kompletta RNAscope analysprotokollet och visa sin användning vid detektion av HR-HPV i FFPE tumörvävnadssnitt.
Protocol
1. Prov, utrustning, och Reagensberedning
- Skär vävnadsprovet i block av 3-4 mm i tjocklek, fixera i färsk 10% neutral buffrad formalin under 16-32 timmar vid rumstemperatur (25 ° C) och bäddas in i paraffin. Skär FFPE i sektioner av 5 ± 1 mikrometer tjocklek från FFPE block, montera avsnitt om bilder och lufttorka. OBS: Bilderna kan förvaras i rumstemperatur under uttorkning i upp till 3 månader. De monterade vävnadsobjektglas bör gräddas i en torka över vid 60 ° C under 1 h före det RNAscope assay.
- Bring hybridiseringsugn till 40 ° C. Placera en befuktnings Paper i fuktkontroll facket. Lägg till 50 ml dH 2 O till befuktnings Paper att blöta det helt. Sätt i den täckta fack i ugnen till Förvärm i minst 30 minuter före användning.
- Gör 700 ml 1x förbehandla 2 Solution (10 nl, pH 6 citratbuffert) genom att späda 10x förbehandlingslösningen i dH 2 O. Värm 1x förbehandla 2 Lösning för att koka och maintain temperaturen mellan 100-104 ° C och samtidigt förhindra överkokning.
- Gör 3 L 1x tvättbuffert (0,1 x SSC) genom att späda förvärmd 50x tvättbuffert i dH 2 O.
- Bered 2 x 200 ml xylen och 2 x 200 ml 100% EtOH för avparaffinering under en huv.
- Förbered 50% Hematoxylin färglösningen och blåelse reagens (0,01% ammoniak) för post-färgning under en huv.
- Bered 200 ml xylen, 200 ml 70%, och 2 x 200 ml 100% EtOH för uttorkning under en huv.
- Förvärm Target-prober vid 40 ° C under 10 min och föra RTU Detection Kit reagens till rumstemperatur, inklusive RTU AMP1, AMP2, Amp3, AMP4, Amp 5-Brown och Amp6-Brown, utom DAB kromogen Brown-A och Brown-B .
2. RNAscope Assay
Avparaffinering och dehydrering
Efter bakning, Avparaffinera vävnadssnitt i xylen för 2 x 5 min med täta agitation, och torkai 100% EtOH under 2 x 3 min med frekvent omröring. Lufttorka i 5 min och dra en hydrofob barriär runt vävnaden avsnitt med en hydrofob barriär Pen.
Förbehandlingar
- Inkubera vävnadssnitt med förbehandla en under 10 min vid RT under släckning av endogen peroxidasaktivitet, skölj i dH 2 O.
- Inkubera vävnadssnitt med förbehandla 2 hålls vid en koktemperatur under 15 min för RNA-återvinning, skölj två gånger i dH 2 O.
- Inkubera vävnadssnitt med förbehandla 3 i 30 min vid 40 ° C för proteinupptaget i HybEZ ugn, skölj två gånger i dH 2 O.
Målsond Hybridisering
Drabbade prober HPV-HR 7 pool inkluderar: HPV-16, 18, 31, 33, 35, 52, och 58. Lägg HPV-sonder, Ubiquitin C (UBC) och bakteriell gen dapB sonder separat på tre intilliggande vävnadssnitt. Hybridisera vid 40 ° C i ugn i 2hr, skölj sedan i 1x tvättbuffert för 2 x 2 min vid RT.
Signalförstärkning
- Inkubera vävnadssnitt med AMP1 (förförstärkare) i 30 minuter vid 40 ° C, AMP2 (bakgrunds reducering) i 15 minuter vid 40 ° C, Amp3 (förstärkare) i 30 minuter vid 40 ° C, och AMP4 (etikett sond) i 15 min vid 40 ° C i HybEZ ugnen. Efter varje hybridiseringssteg, skölj i 1X tvättbuffert för 2 x 2 min vid rumstemperatur.
- Inkubera vävnadssnitt med Amp5 under 30 min och Amp6 under 15 min vid RT. Efter varje inkubationssteg, skölj i 1X tvättbuffert för 2 x 2 min vid rumstemperatur.
Signal Detection
Inkubera vävnadssnitt med 01:01 DAB Blandning genom blandning av lika stor volym av Brown-A och Brown-B under 10 min vid RT, skölj två gånger i dH 2 O.
Motfärgning
Skjut Montering
Dehydrera vävnadssektioner i 70%, 100% och 100% EtOH under 2 min vardera, xylen under 5 min, Fäste med xylen-baserat monteringsmedium.
Representative Results
RNAscope HPV-analysen arbetsflöde
Den RNAscope analysen har ett mycket effektivt arbetsflöde som liknar IHC (figur 1). Den består av fyra stora steg: förbehandlingar, hybridisering, signal förstärkningar, och upptäckt. Den använder en unik sonddesignstrategi som garanterar hög trohet signalförstärkning 5. I RNAscope HPV-analys, är de sju HR-HPV-probuppsättningar poolades, alla igen av samma signalförstärkning system kopplat till pepparrotsperoxidas (HRP). Specifika hybridiseringssignaler detekteras som bruna fällningar bildade av HRP katalyserad kromogen reaktion med DAB som substrat, som lätt kan visualiseras genom standard ljusfältsmikroskopi.
Representant färgning för HPV-detektion
Figur 2 visar exempel bilder från färgade FFPE delar av huvud och hals skivepitelcancer. I den HPV-positiva fall (Figure 2A), de HR-HPV-sonder detekterades starka punktuell signaler specifikt i tumörcellerna. UBC sonden detekteras ett flertal punktuell cytoplasmiska signaler i både tumörceller och stromaceller (Figur 2B). Den bakteriella genen dapB sond visade en ren bakgrund (figur 2C). I den HPV-negativa fall, både HR-HPV-sonden och dapB sonden upptäckt några signaler (figurerna 2D och 2F), medan starka signaler detekterades med hjälp av UBC sonden (Figur 2E). I denna analys, UBC tjänar som positiv kontroll för att bedöma vävnads RNA kvalitet och dapB som negativ kontroll för bakgrundssignaler. Poängsättningen för HPV-statusbestämning innefattar att granska alla tre bilder för varje enskilt fall. Färgnings nivå på det negativa kontrollobjektglaset (dapB) glider används som cutoff: HPV positivitet definieras genom närvaron av punktuell cytoplasmiska och / eller nukleär färgning som var högre än signalen på dabpB slide.
Figur 1. Flödesschema av RNAscope analys. Illustration av RNAscope analys arbetsflöde. Den RNAscope analysen innehåller 4 stora steg, förbehandlingar, målsonden hybridisering, signalförstärkning och signaldetektering. Hela analysförfarandet kan slutföras i 8 tim. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Exempel bilder av RNAscope-färgade objektglas. FFPE sektioner färgade med prober för HR-HPV, UBC (positiv kontroll) och dapB (negativ kontroll)från två HNSCC fall. AC. HPV-positiva fall. A, HR-HPV E6/E7 mRNA-uttryck i tumörceller. Inset, 40X förstoring för att visa punktformig signaler. B och C) intilliggande vävnadssnitt som visar positiv UBC färgning (B) och negativa för dapB (C), respektive. DF) HPV-negativa fall. D) ingen färgning för HPV E6/E7 mRNA , liknande den dapB negativa kontrollen (F). E) UBC positiv färgning. Klicka här för att visa en större bild.
Discussion
Den RNAscope HPV-analysen får direkt visualisering av E6/E7 mRNA in situ i HPV-associerad huvud och hals skivepitelcancer. Den RNAscope analysen är helt kompatibel med rutinmässigt fixerad tumörvävnad och bevarar vävnadsmorfologi för histopatologiska korrelationer (Figur 2). En viktig fördel med RNAscope analysen över konventionella CISH metoder är att det uttryckligen förstärker hybridiseringssignalerna (figur 2B och 2E) utan att förstärka bakgrundsljud (figur 2C och 2F).
I praktiken kan det RNAscope HPV-analysproceduren avslutas inom 8 h eller bekvämt uppdelad över två dagar. Den RNAscope HPV-analysen har använts för att bestämma HPV status i huvud och hals skivepitelcancer 12-16, visar 97% sensitivitet och 93% specificitet med hjälp av QRT-PCR som referensmetod 16. Konventionell chromogenic ISH för HR-HPV-DNA är höggradigt specifik men har en känslighet av ~ 80% 12. Immunhistokemisk (IHC) färgning för den cellulära surrogatmarkör p16 visar utmärkt känslighet men kan ge falskt positiva resultat 15,18, särskilt i nonoropharyngeal huvud-halscancer 15. Den nuvarande "gyllene standard" metod för QRT-PCR för HPV E6/E7 mRNA detektion kräver fryst vävnad för optimala resultat och är tekniskt komplicerat, vilket begränsar dess användning till forskningen enda laboratorium. Dessutom kräver det RNA-extraktion som gör det omöjligt att korre HR-HPV E6/E7 mRNA-expression med histopatologi.
Det finns flera kritiska faktorer för framgången av RNAscope assay. Först, för bästa resultat, vävnader bör fastställas i färska 10% neutral buffrad formalin vid rumstemperatur i 16-32 timmar enligt riktlinjer ASCO / CAP 19. För det andra är HybEZ ugnen rekommenderas eftersom det gör det möjligts optimal kontroll av temperatur och fuktighet för probhybridisering och signalförstärkning steg. För det tredje är det viktigt att avlägsna överskott av rest buffertar före varje steg, men ändå hålla vävnadssnittet från att torka under någon av dessa steg.
Den manuella RNAscope förfarande som beskrivs här är helt automatiserad kommersiell slide automatisk färgning systemet 10. Detta skulle i hög grad underlätta standardisering av analysförhållanden och sparar värdefull kroppsarbete i klinisk patologi laboratorier. Dessutom har dedikerade bildanalys programvara utvecklats 10 för att automatiskt identifiera celler och färgsignaler på en digitaliserad bild, vilket bör bidra till att eliminera subjektivitet och förbättra reproducerbarhet i att göra poäng.
Sammanfattningsvis detekterar RNAscope HPV-analysen närvaron av HR-HPV E6/E7 mRNA-transkript in situ i FFPE vävnader. Den har ett arbetsflöde som är bekant för klinisk patologi laboratorier genom att tillåta direkt visualisering av dessa i vävnadssektioner. Den erbjuder en perfekt plattform för att pröva (FFPE) vävnadsprover, och kan lätt antas av diagnostiska patologilaboratorier.
Disclosures
Alla författare är anställda och egna lager i Advanced Cell Diagnostics, Inc.
Acknowledgments
Stöds delvis av NIH bidrag (R43/44CA122444) och DOD BRCP bidrag (W81XWH-06-1-0682) till YL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60±1 °C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40±1 °C |
References
- Parkin, D. M. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).
- Chaturvedi, A. K., et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).
- Smeets, S. J., et al. A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen. Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Liu, X., et al. Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity. J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Payne, R. E., et al. Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients. Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).
- Bordeaux, J. M., et al. Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen. PLoS One. 7 (5), (2012).
- Wang, Z., et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).
- Tubbs, R. R., et al. Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).
- Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization. Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status. Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).
- Bishop, J. A., et al. Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method. Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Schache AG,, et al. Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).
- Mehrad, M., et al. Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus. Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).
- Jordan, R. C., et al. Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials. Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).
