Injection intraestriatal de sangue autólogo ou Clostridial colagenase como modelos murinos de hemorragia intracerebral

Summary

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Abstract

Hemorragia intracerebral (ICH) é uma forma comum de doença vascular cerebral e está associada a significativa morbidade e mortalidade. A falta de tratamento eficaz e fracasso de grandes ensaios clínicos destinados a hemostasia e remoção do coágulo demonstrar a necessidade de mais-driven mecanismo de investigação do ICH. Esta pesquisa pode ser realizada através da estrutura fornecida pelos modelos pré-clínicos. Dois modelos murinos em uso popular incluem intrastriatal (gânglios basais) ou injeção de sangue autólogo todo ou colagenase clostridiana. Uma vez que, cada modelo representa distintamente diferentes características fisiopatológicas relacionadas com HIC, o uso de um determinado modelo pode ser seleccionado com base no que os aspectos da doença está a ser estudado. Por exemplo, a injeção de sangue autólogo representa com mais precisão a resposta do cérebro à presença de sangue intraparenquimatosa, e pode replicar mais de perto hemorragia lobar. Clostridial injeção de colagenase representa com mais precisão as sruptura do vaso shopping e hematoma evolução característica de hemorragias profundas. Assim, cada modelo resulta na formação diferente hematoma, resposta neuroinflammatory, desenvolvimento de edema cerebral, e os resultados neurocomportamentais. Robustez de uma intervenção terapêutica pretendida pode ser melhor avaliada por ambos os modelos. Neste protocolo, a indução da ICH usando ambos os modelos, a demonstração de pós-operatório imediato de lesão, e técnicas de primeiros cuidados pós-operatórios são demonstrados. Ambos os modelos resultar em lesões reprodutíveis, volumes hematoma e déficits neurocomportamentais. Devido à heterogeneidade do ICH humana, vários modelos pré-clínicos são necessários para explorar completamente os mecanismos fisiopatológicos e testar estratégias terapêuticas potenciais.

Introduction

Hemorragia intracerebral (ICH) é uma forma relativamente comum de doença cerebrovascular, com cerca de 40-50% dos pacientes que sofrem de morrer dentro de 30 dias ^1. Infelizmente, pouca melhoria foi feita na taxa de mortalidade nos últimos 20 anos ^2. Os relatórios dos Institutos Nacionais de Saúde ³ e diretrizes da American Heart Association ⁴ sublinhou a importância do desenvolvimento de modelos clinicamente relevantes de ICH para ampliar a compreensão da fisiopatologia e desenvolver alvos para novas abordagens terapêuticas.

Existem diversos modelos de imitar ICH humano ^5. Como compreensão da patofisiologia da ICH amadurece, tornou-se evidente que uma variedade de modelos podem ser utilizados para examinar diferentes aspectos da doença. Modelos utilizados anteriormente incluem murino angiopatia amilóide ^6, inserção microbalão intraparenquimatosa e inflação ^7, eo sangue arterial diretainfiltração de ^8,9. Lobar de angiopatia amilóide foi modelada com a utilização de ratos transgénicos e representa um subtipo ICH distinta. Modelos microbalão imitar efeito de massa aguda de formação de hematoma, mas não conseguem capturar a resposta celular do cérebro para a presença de sangue. Finalmente, a infiltração do sangue arterial direta sujeita o cérebro a pressão arterial da artéria femoral. Assim, este modelo reproduz pressão arterial ea presença de sangue, mas não submeta o cérebro a lesão microvascular de ruptura de pequenos vasos de sangue. Além disso, este modelo tem inerentemente uma alta variabilidade. Curiosamente, ratos espontaneamente hipertensos ¹⁰ desenvolver ICH espontânea à medida que envelhecem. O estudo destes animais após o desenvolvimento de HIC pode imitar a doença na presença de um dos principais co-morbidades que predispõem os seres humanos para HIC. Embora existam esses outros modelos, injeção intrastriatal de Clostridial colagenase ¹¹ ou injeção instrastiatal de umtodo utologous sangue ¹² são, atualmente, os dois modelos mais comuns utilizados na pesquisa pré-clínica ICH.

ICH selecção do modelo deve ser feita com base no objectivo de questão experimental, incluindo a seleção de espécies e método de induzir a formação de hematoma. Por exemplo, os porcos são grandes animais com volumes relativamente grandes de substância branca do cérebro, em comparação com ratinhos. Assim, os modelos de suínos são adequados para estudar a fisiopatologia da substância branca após ICH. Em contraste, os cérebros de roedores são matéria em grande parte cinza, mas sistemas de transgênicos fazem roedores útil para avaliar os mecanismos moleculares de lesão e recuperação após ICH. Cada modelo tem seus pontos fortes e fracos (Tabela 1) inerentes, que devem ser cuidadosamente considerados antes da experimentação.

Os seguintes protocolos de demonstrar o sangue e injecção colagenase modelos autólogas em ratinhos. Estes modelos têm cada foram traduzidos a partir de modelos desenvolvidos originalmente em ratos^13,14 e permitir a utilização de tecnologia transgénica largamente disponível para explorar mecanismos moleculares associadas com a morte celular após a ICH. Ambos representam distintamente diferentes mecanismos de lesão do ICH humano, e ambos têm resultado esperado distintamente diferentes em termos de medidas comportamentais e histológicas. Assim, certas hipóteses podem prestar-se a um modelo sobre o outro, mas muitas ideias podem exigir validação em ambos os modelos.

Tabela 1. Comparação das características de injeção de sangue autólogo modelos hemorragia intracerebral colagenase-e.

<tr>

	Colagenase Injeção	Injeção de sangue
Fácil de Usar	+ + +	+ +
Reprodutibilidade	+ +	+ +
Controle de Hemorragia Tamanho	+ +	+ + +
Refluxo de sangue	+	+ +
Simula Doenças Humanas	+	–
Simplicidade	+ +	+ +
Uso em múltiplas espécies	+ +	+ +

Protocol

Declaração de Ética: Este protocolo foi aprovado pelo Comitê da Universidade Duke Institutional Animal Care e Use e segue todas as diretrizes para o uso ético de animais. 1. Preparação de Equipamento Autoclave os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Desinfectar o aparelho estereotáxico com etanol a 70%. Ligue banho de água e manter a temperatura da água a 42 ° C. Dissolver tipo IV-S colagenase de Clostridium, em solução salina norm…

Representative Results

Devido às diferenças na formação de hematoma (Figura 1), de virada ipsilateral é mostrado imediatamente após o despertar para o sangue autólogo camundongos injetados e dentro de 2-4 horas após a injeção de colagenase, como a expansão do hematoma ocorre (Figura 2). Ausência de viragem ipsilateral deve causar preocupação para a ausência de lesões significativas. No primeiro dia pós lesão, os ratos de ambos os modelos devem demonstrar déficits neurológicos significativo…

Discussion

Apesar emergente pesquisa pré-clínica e grandes ensaios clínicos resultantes para prometendo terapêutica ^15-18, não há intervenções farmacológicas demonstraram para melhorar o resultado na ICH e cuidados permanece em grande parte de suporte. As listas de possíveis terapias podem ser gerados pelas tecnologias de alto rendimento, como o trabalho transcriptomic e proteômica. Embora estas tecnologias continuam a avançar o nosso conhecimento de potenciais alvos terapêuticos, para frente e para trás t…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 µl Hamilton syringe	Hamilton Co.	86259	25 gauge needle
50 µl Hamilton syringe	Hamilton Co	7637-01
26G Hamilton needle	Hamilton Co	7804-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20-gauge, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE20	Becton-Dickinson	427406
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
30G 1 inch needle	Becton-Dickinson	305128
27G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD