Inyección intraestriatal de sangre autóloga o clostridial colagenasa como modelos murinos de la hemorragia intracerebral

Summary

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Abstract

La hemorragia intracerebral (ICH) es una forma común de enfermedad cerebrovascular y se asocia con morbilidad y mortalidad significativas. La falta de tratamiento y el fracaso efectivo de grandes ensayos clínicos dirigidos a la hemostasia y la eliminación de coágulos demostrar la necesidad de una mayor investigación mecanismo impulsado de ICH. Esta investigación se puede realizar a través del marco establecido por los modelos preclínicos. Dos modelos murinos en uso popular incluyen (ganglios basales) inyección intraestriatal de sangre entera autóloga o colagenasa clostridial. Dado que, cada modelo representa claramente diferentes características fisiopatológicas relacionadas con la ICH, el uso de un modelo en particular se puede seleccionar sobre la base de qué aspecto de la enfermedad es a ser estudiado. Por ejemplo, la inyección de sangre autóloga representa con mayor precisión la respuesta del cerebro a la presencia de sangre intraparenquimatosa, y puede reproducir más de cerca posible hemorragia lobar. Inyección de colagenasa clostridial representa con mayor precisión las sruptura de los vasos centro comercial y hematoma evolución característico de hemorragias profundas. Por lo tanto, cada uno de los resultados del modelo en diferente formación de hematomas, neuroinflammatory respuesta, el desarrollo de edema cerebral, y los resultados neuroconductuales. La robustez de una intervención terapéutica pretendida puede ser mejor evaluada usando ambos modelos. En este protocolo, la inducción de ICH con modelos de demostración, post-operatorio inmediato de la lesión, y las técnicas de atención postoperatoria temprana se demuestran. Ambos modelos resultan en lesiones reproducibles, volúmenes hematoma, y ​​déficits neuroconductuales. Debido a la heterogeneidad de ICH humana, se necesitan varios modelos preclínicos para explorar a fondo los mecanismos fisiopatológicos y probar estrategias terapéuticas potenciales.

Introduction

La hemorragia intracerebral (HIC) es una forma relativamente común de enfermedad cerebrovascular con aproximadamente el 40-50% de los pacientes afectados de morir dentro de 30 días ^1. Desafortunadamente, pocas mejoras se han hecho en la tasa de mortalidad en los últimos 20 años ^2. Los informes de los Institutos Nacionales de Salud ³ y las directrices de la American Heart Association ⁴ subrayaron la importancia de desarrollar modelos clínicamente relevantes de ICH para ampliar la comprensión de la fisiopatología y desarrollar objetivos para nuevos enfoques terapéuticos.

Existen varios modelos para imitar ICH humana ^5. Como la comprensión de la fisiopatología de la ICH madura, se ha hecho evidente que una variedad de modelos puede ser utilizado para examinar diferentes aspectos de la enfermedad. Modelos utilizados anteriormente incluyen angiopatía amiloide murino ^6, inserción microbalón intraparenquimatosa y la inflación ^7, y la sangre arterial directainfiltración de ^8,9. Lobar hemorragia de angiopatía amiloide se ha modelado con el uso de ratones transgénicos y representa un subtipo de la ICH distinta. Modelos microbalón imitan el efecto de masa aguda de la formación de hematomas, pero no logran captar la respuesta celular del cerebro a la presencia de sangre. Por último, la infiltración de sangre arterial directa somete el cerebro a las presiones arteriales de la arteria femoral. Por lo tanto, este modelo imita presiones arteriales y la presencia de sangre, pero no somete al cerebro a la lesión microvascular de pequeña ruptura de los vasos sanguíneos. Además, este modelo tiene inherentemente alta variabilidad. Curiosamente, las ratas espontáneamente hipertensas ¹⁰ desarrollan HIC espontánea a medida que envejecen. El estudio de estos animales después del desarrollo de la ICH puede imitar la enfermedad en presencia de uno de los principales comorbilidades que predisponen a los seres humanos de la ICH. Si bien existen estos otros modelos, la inyección de intraestriatal clostridial colagenasa ¹¹ o inyección instrastiatal de unsangre entera utologous ¹² son, en la actualidad, los dos modelos más comunes utilizados en la investigación preclínica ICH.

La selección del modelo de la ICH debe hacerse con base en el objetivo de la pregunta experimental, incluyendo la selección y el método de inducir la formación de hematomas especies. Por ejemplo, los cerdos son animales grandes con volúmenes relativamente grandes de la materia blanca del cerebro en comparación con los ratones. Por lo tanto, son adecuados modelos porcinos para estudiar la materia blanca fisiopatología siguiente ICH. En contraste, los cerebros de roedores son materia principalmente de color gris, pero los sistemas transgénicos hacen roedores útil para evaluar los mecanismos moleculares de la lesión y la recuperación después de la ICH. Cada modelo tiene sus fortalezas y debilidades (Tabla 1) inherentes, que debe ser considerado cuidadosamente antes de la experimentación.

Los siguientes protocolos demuestran los modelos de sangre y de inyección de colagenasa autólogas en ratones. Estos modelos han sido cada uno traducida de modelos desarrollados originalmente en ratas^13,14 y permitir el uso de la tecnología transgénica ampliamente disponibles para explorar los mecanismos moleculares asociados con la muerte celular después de la ICH. Ambos representan claramente diferentes mecanismos de lesión de ICH humano, y ambos tienen muy diferentes resultados esperados en términos de medidas conductuales e histológicas. Por lo tanto, ciertas hipótesis pueden prestarse a un modelo sobre el otro, pero muchas ideas pueden requerir la validación en ambos modelos.

Tabla 1. Comparación de las características de los modelos de hemorragia intracerebral inyección de sangre autóloga colagenasa-e.

<tr>

	La inyección de colagenasa	Inyección de sangre
Facilidad de Uso	+ + +	+ +
Reproducibilidad	+ +	+ +
Control de la Hemorragia Tamaño	+ +	+ + +
El reflujo de sangre	+	+ +
Simula Enfermedades Humanas	+	–
Sencillez	+ +	+ +
El uso en múltiples especies	+ +	+ +

Protocol

Declaración de Ética: Este protocolo ha sido aprobado por el Comité de la Universidad de Duke Institucional Cuidado de Animales y Uso y sigue todas las pautas para el uso ético de los animales. 1. Preparación de Equipo Autoclave las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía. Desinfectar el aparato estereotáctico con etanol al 70%. Encienda el baño de agua y mantener la temperatura del agua a 42 ° C. Disolver Tipo IV-S clostridial colagena…

Representative Results

Debido a las diferencias en la formación de un hematoma (Figura 1), giro ipsilateral se muestra inmediatamente después de despertar para los ratones inyectados de sangre autóloga y dentro de 2 a 4 horas después de la inyección de colagenasa, como la expansión del hematoma se produce (Figura 2). Ausencia de giro ipsilateral debe plantear la preocupación por la ausencia de lesiones significativas. En el primer día después de la lesión, los ratones en ambos modelos deben demostra…

Discussion

A pesar de que emerge la investigación preclínica y grandes ensayos clínicos resultantes de la promesa de la terapéutica de ^15-18, no hay intervenciones farmacológicas demostradas para mejorar el resultado en el ICH, y la atención se mantiene en gran medida de apoyo. Las listas de posibles terapias pueden ser generados por tecnologías de alto rendimiento, como el trabajo transcriptómica y proteómica. Si bien estas tecnologías siguen avanzando nuestro conocimiento de posibles dianas terapéuticas, Tr…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 µl Hamilton syringe	Hamilton Co.	86259	25 gauge needle
50 µl Hamilton syringe	Hamilton Co	7637-01
26G Hamilton needle	Hamilton Co	7804-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20-gauge, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE20	Becton-Dickinson	427406
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
30G 1 inch needle	Becton-Dickinson	305128
27G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD