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Injection intraestriatal de sangue autólogo ou Clostridial colagenase como modelos murinos de hemorragia intracerebral

Published: July 3, 2014 doi: 10.3791/51439
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1,4, 1,2,4, 1,2
1Multidisciplinary Neuroprotection Laboratories, Department of Anesthesiology, Duke University, 2Department of Neurology, Duke University, 3Department of Radiology, Duke University, 4Department of Neurobiology, Duke University

Abstract

Hemorragia intracerebral (ICH) é uma forma comum de doença vascular cerebral e está associada a significativa morbidade e mortalidade. A falta de tratamento eficaz e fracasso de grandes ensaios clínicos destinados a hemostasia e remoção do coágulo demonstrar a necessidade de mais-driven mecanismo de investigação do ICH. Esta pesquisa pode ser realizada através da estrutura fornecida pelos modelos pré-clínicos. Dois modelos murinos em uso popular incluem intrastriatal (gânglios basais) ou injeção de sangue autólogo todo ou colagenase clostridiana. Uma vez que, cada modelo representa distintamente diferentes características fisiopatológicas relacionadas com HIC, o uso de um determinado modelo pode ser seleccionado com base no que os aspectos da doença está a ser estudado. Por exemplo, a injeção de sangue autólogo representa com mais precisão a resposta do cérebro à presença de sangue intraparenquimatosa, e pode replicar mais de perto hemorragia lobar. Clostridial injeção de colagenase representa com mais precisão as sruptura do vaso shopping e hematoma evolução característica de hemorragias profundas. Assim, cada modelo resulta na formação diferente hematoma, resposta neuroinflammatory, desenvolvimento de edema cerebral, e os resultados neurocomportamentais. Robustez de uma intervenção terapêutica pretendida pode ser melhor avaliada por ambos os modelos. Neste protocolo, a indução da ICH usando ambos os modelos, a demonstração de pós-operatório imediato de lesão, e técnicas de primeiros cuidados pós-operatórios são demonstrados. Ambos os modelos resultar em lesões reprodutíveis, volumes hematoma e déficits neurocomportamentais. Devido à heterogeneidade do ICH humana, vários modelos pré-clínicos são necessários para explorar completamente os mecanismos fisiopatológicos e testar estratégias terapêuticas potenciais.

Introduction

Hemorragia intracerebral (ICH) é uma forma relativamente comum de doença cerebrovascular, com cerca de 40-50% dos pacientes que sofrem de morrer dentro de 30 dias 1. Infelizmente, pouca melhoria foi feita na taxa de mortalidade nos últimos 20 anos 2. Os relatórios dos Institutos Nacionais de Saúde 3 e diretrizes da American Heart Association 4 sublinhou a importância do desenvolvimento de modelos clinicamente relevantes de ICH para ampliar a compreensão da fisiopatologia e desenvolver alvos para novas abordagens terapêuticas.

Existem diversos modelos de imitar ICH humano 5. Como compreensão da patofisiologia da ICH amadurece, tornou-se evidente que uma variedade de modelos podem ser utilizados para examinar diferentes aspectos da doença. Modelos utilizados anteriormente incluem murino angiopatia amilóide 6, inserção microbalão intraparenquimatosa e inflação 7, eo sangue arterial diretainfiltração de 8,9. Lobar de angiopatia amilóide foi modelada com a utilização de ratos transgénicos e representa um subtipo ICH distinta. Modelos microbalão imitar efeito de massa aguda de formação de hematoma, mas não conseguem capturar a resposta celular do cérebro para a presença de sangue. Finalmente, a infiltração do sangue arterial direta sujeita o cérebro a pressão arterial da artéria femoral. Assim, este modelo reproduz pressão arterial ea presença de sangue, mas não submeta o cérebro a lesão microvascular de ruptura de pequenos vasos de sangue. Além disso, este modelo tem inerentemente uma alta variabilidade. Curiosamente, ratos espontaneamente hipertensos 10 desenvolver ICH espontânea à medida que envelhecem. O estudo destes animais após o desenvolvimento de HIC pode imitar a doença na presença de um dos principais co-morbidades que predispõem os seres humanos para HIC. Embora existam esses outros modelos, injeção intrastriatal de Clostridial colagenase 11 ou injeção instrastiatal de umtodo utologous sangue 12 são, atualmente, os dois modelos mais comuns utilizados na pesquisa pré-clínica ICH.

ICH selecção do modelo deve ser feita com base no objectivo de questão experimental, incluindo a seleção de espécies e método de induzir a formação de hematoma. Por exemplo, os porcos são grandes animais com volumes relativamente grandes de substância branca do cérebro, em comparação com ratinhos. Assim, os modelos de suínos são adequados para estudar a fisiopatologia da substância branca após ICH. Em contraste, os cérebros de roedores são matéria em grande parte cinza, mas sistemas de transgênicos fazem roedores útil para avaliar os mecanismos moleculares de lesão e recuperação após ICH. Cada modelo tem seus pontos fortes e fracos (Tabela 1) inerentes, que devem ser cuidadosamente considerados antes da experimentação.

Os seguintes protocolos de demonstrar o sangue e injecção colagenase modelos autólogas em ratinhos. Estes modelos têm cada foram traduzidos a partir de modelos desenvolvidos originalmente em ratos13,14 e permitir a utilização de tecnologia transgénica largamente disponível para explorar mecanismos moleculares associadas com a morte celular após a ICH. Ambos representam distintamente diferentes mecanismos de lesão do ICH humano, e ambos têm resultado esperado distintamente diferentes em termos de medidas comportamentais e histológicas. Assim, certas hipóteses podem prestar-se a um modelo sobre o outro, mas muitas ideias podem exigir validação em ambos os modelos.

Tabela 1. Comparação das características de injeção de sangue autólogo modelos hemorragia intracerebral colagenase-e.

Reprodutibilidade
Colagenase Injeção Injeção de sangue
Fácil de Usar + + + + +
+ + + +
Controle de Hemorragia Tamanho + + + + +
Refluxo de sangue + + +
Simula Doenças Humanas + -
Simplicidade + + + +
Uso em múltiplas espécies + + + +

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Protocol

Declaração de Ética: Este protocolo foi aprovado pelo Comitê da Universidade Duke Institutional Animal Care e Use e segue todas as diretrizes para o uso ético de animais.

1. Preparação de Equipamento

  1. Autoclave os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia.
  2. Desinfectar o aparelho estereotáxico com etanol a 70%.
  3. Ligue banho de água e manter a temperatura da água a 42 ° C.
  4. Dissolver tipo IV-S colagenase de Clostridium, em solução salina normal com uma concentração de 0,075 L por 0,4 ul.

2. Injeção Modelo colagenase

  1. Pesar o mouse.
  2. Anestesiar o mouse em uma câmara de indução com 5% de isoflurano em 30% O 2/70% N2. Anestesia adequada é sinalizado após cerca de 2 min, quando respirations rato ter abrandado a 1 por segundo.
  3. Entubar a traqueia com um G 30 mm 20 cateter intravenoso.
  4. Conectar o cateter para umventilador roedor e ventilar mecanicamente os pulmões com 1,6% de isoflurano em 30% O 2/70% N2 a uma taxa de 105 ciclos por minuto, com um volume corrente fornecido de 0,75 ml ..
  5. Raspar o couro cabeludo com um barbeador eletrônico. Uma vez que o mouse é anestesiado e entubado, movê-lo para uma estação de trabalho diferente para fazer a barba e, em seguida, voltou para o banco cirúrgico.
  6. Fixe a cabeça em um quadro estereotáxico, e nivelar a cabeça com sutura tanto coronal e sagital, como pontos de referência.
  7. Aplicar pomada oftálmica para os olhos.
  8. Insira uma sonda de temperatura retal. Manter a temperatura rectal em 37,0 ± 0,2 ° C usando um colchão de água em circulação substrutura.
  9. Limpe a área cirúrgica com betadine seguido com etanol 70% e repetir 3 vezes.
  10. Faça uma incisão no couro cabeludo um centímetro da linha média e limpe periósteo lateralmente com um aplicador com ponta de algodão estéril para expor bregma.
  11. Exercício 1 mm de diâmetro burr hole 2,2 milímetros deixou latral para bregma com uma broca refrigerado a água.
  12. Gire colagenase frasco 5 vezes, em seguida, lave a seringa de 0,5 mL com agulha 25 G (anexo ao quadro estereotáxico) com 0,5 mL solução de colagenase 5 vezes (Deixar de 0,5 ml de solução de colagenase em seringa após a última lavagem).
  13. Alinhe a ponta da agulha com orifício de trepanação, em seguida, expulsar 0,1 mL da seringa e limpe a agulha de bisel com navalha descartar.
  14. Usando um micromanipulador, avançar a agulhas 3 mm de profundidade ao córtex e deixar imóvel por 30 seg.
  15. Injetar 0,4 mL mais de 90 seg.
  16. Diminuir isoflurano a 1% e deixar agulha imóvel por 5 min.
  17. Retire a agulha lentamente.
  18. Aplicar 1-2 gotas de bupivacaína a 0,25% por via subcutânea e suturar a pele.
  19. Desligue o isoflurano vaporizador e retire do mouse a partir do quadro estereotáxico.
  20. Permitir mouse para recuperar a ventilação espontânea com posterior extubação traqueal.
  21. Retorno do mouse para uma gaiola limpa e permitir o acesso livre paraalimentos e água.

3. Autólogo Modelo Injeção de sangue

  1. Siga os passos 2,1-2,11 para o modelo de injeção de colagenase.
  2. Desenhar 50 ul de solução salina normal estéril numa seringa de 30 mL, G 50.
  3. Conecte a seringa microlitro com um tubo PE10 70 centímetros.
  4. Expulse todo o soro fisiológico do microlitro seringa no tubo PE10 completamente a tubulação de ar-DE.
  5. Puxar o êmbolo da seringa para fora microlitro de 1 mM a fazer uma bolha de ar na abertura distal do aparelho de seringa de tubo PE10-microlitro para evitar a mistura de solução salina e de sangue durante procedimentos posteriores.
  6. Seque a região da artéria caudal centro distal do rato com etanol a 70%, e cortar a artéria com uma lâmina de 0,5 a 1 cm para a ponta da cauda.
  7. Recolha de 40 mL de sangue a partir da cauda cortada em o aparelho de seringa de tubo PE10-microlitro. Nota: que a heparina não é usado na agulha, tubo ou um rato.
  8. Fixe a seringa microlitro na injebomba cção.
  9. Ligue a porção de cânula metálica de uma agulha de 27 G para a extremidade do tubo PE10, e proteger a agulha a um micromanipulador na armação estereotáxica.
  10. Expulse 2 l de sangue de 27 G agulha e limpe a agulha de bisel com navalha descartar.
  11. Alinhe a ponta da agulha com orifício de trepanação e inserir as agulhas 3 mm de profundidade ao córtex.
  12. Injectar 35 mL de sangue autólogo, a uma taxa de 2 mL por minuto.
  13. Diminuir isoflurano a 1% e deixar agulha imóvel por 10 min.
  14. Retire a agulha mais de 30 seg.
  15. Aplicar 1-2 gotas de bupivacaína a 0,25% por via subcutânea e suturar a pele.
  16. Desligue o isoflurano vaporizador e retire do mouse a partir do quadro estereotáxico.
  17. Permitir mouse para recuperar a ventilação espontânea com extubação subseqüente.
  18. Retorno do mouse para uma gaiola limpa e permitir o acesso livre à comida e água.

4. Sham Operação

  1. Siga os mesmos procedimentos para a colagenase injectiomodelo n, exceto sem injeção após a inserção da agulha.

5. Cuidados pós-cirurgia

  1. Injectar 0,5 mL de uma solução salina normal subcutaneamente na noite do procedimento cirúrgico na parte de trás do pescoço do animal.
  2. Fornecer comida amolecida com água e comida de gel em pequenas chávenas de plástico colocadas sobre o chão da gaiola. Substitua os alimentos por dia durante 7 dias.
  3. Verifique se há perda de peso, cicatrização de feridas, e sinais de desconforto por dia durante 7 dias.
  4. Se são requeridos intervalos de recuperação superiores a 7 dias, a remoção da sutura pode ser realizada sob anestesia leve inalado (aproximadamente 1% de isoflurano em 30% O 2/70% N 2), se necessário.

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Representative Results

Devido às diferenças na formação de hematoma (Figura 1), de virada ipsilateral é mostrado imediatamente após o despertar para o sangue autólogo camundongos injetados e dentro de 2-4 horas após a injeção de colagenase, como a expansão do hematoma ocorre (Figura 2). Ausência de viragem ipsilateral deve causar preocupação para a ausência de lesões significativas. No primeiro dia pós lesão, os ratos de ambos os modelos devem demonstrar déficits neurológicos significativos (Figura 3). Em 24 horas após a injecção, os hemisférios ipsilateral mostram volumes hematoma estáveis ​​(Figura 4); além disso, em 24 horas após a injecção, o conteúdo em água no cérebro deve ser esperado ser 79,8 + 0,34% em ratinhos injectados com colagenase e 79,3 + 0,23% em ratinhos injectados com sanguíneos autólogos. A mortalidade deve ser prevista para ocorrer entre 10 - 25% dos ratinhos injectados com colagenase e menos do que 10% dos ratinhos injectados com sanguíneos autólogos. Morte inevitável devido ao volume do hematoma, edema cerebral, e aumentoupressão intracraniana sed geralmente ocorre dentro do primeiro 24 - 48 horas após a injeção intrastriatal. A morte ocorre após 72 horas pode muitas vezes ser evitadas com bom atendimento pós-lesão (por exemplo., Pronto acesso a comida e água desmineralizada). A recuperação funcional geralmente começa por dia pós lesão 2 com camundongos injetados de sangue autólogo recuperar significativamente mais rápido do que os ratos com injeção de colagenase.

Figura 1
Figura 1. Série de ressonância magnética do cérebro do rato comparando sangue autólogo e colagenase modelos de injeção de hemorragia intracerebral. Após a indução hemorragia intracerebral via injeção intrastriatal esquerda de 35 mL de sangue autólogo (A) ou 0.075 U Tipo IV-S colagenase clostridiana (B) em 10-12 semanas de idade camundongos machos C57/Bl6, serial im ressonância magnéticaenvelhecimento demonstra expansão hematoma nos ratos injetados com colagenase em relação a formação de hematoma estável nos camundongos injetados de sangue autólogo. Hematoma volumes são 10,1, 23,1, 29,9 mm 3 em 1, 6, & 12 hr após injecção de colagenase, respectivamente, e 7,0, 5,8, 3,2 mm 3 em 1, 6 e 24 horas após a injecção de sangue total, respectivamente. favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Teste sua vez Figura 2 Canto em camundongos 24 horas após a hemorragia intracerebral tomada imediatamente após a injeção intrastriatal colagenase em gânglios da base esquerda, presença de resposta de viragem ipsilateral esperado em 10 -.. 12 semanas de idade camundongos machos C57/BL6 denota lesão adequada. Esta viragemdeve ocorrer imediatamente após a lesão significativa em ratinhos injectados com o sangue autólogo e dentro de 2-4 horas, em ratinhos injectados com colagenase. Ratos em ambos os modelos mostraram-se mais à esquerda se transforma após a lesão em comparação com camundongos ileso (** p <0,01; ANOVA one-way com teste post-hoc de Scheffe, n = 10/grupo).

Figura 3
. Figura 3 desempenho Rotarod após hemorragia intracerebral em camundongos pré e pós lesão latências rotorod de 10 -. 12 semanas de idade camundongos machos C57/BL6 para uma semana após esquerdo intraestriatal 35 mL de sangue autólogo-, 0,075 L Tipo IV-S clostridiana colagenase-injeção ou operação simulada (* p = 0,022; medidas repetidas ANOVA com teste post-hoc de Scheffe, F-valor = 12,726; n = 10/grupo). Ratos são avaliados através rotorod testando a cada dois dias após a lesão para evitar os erros de treinamento significativo. </ P>

Figura 4
. Figura 4 hematoxilina e eosina manchas de cérebro do rato após hemorragia intracerebral Fotomicrografias de 10 - 12. Semanas de idade C57/Bl6 masculinos rato cérebros de 24 horas após a injeção de esquerda intrastriatal de 35 mL de sangue autólogo (direita) ou 0.075 U Tipo IV-S Clostridial colagenase (esquerda). Hematoma volumes são 20,2 milímetros 3 após a injeção de colagenase e 6,4 mm 3 após a injeção de sangue total. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Apesar emergente pesquisa pré-clínica e grandes ensaios clínicos resultantes para prometendo terapêutica 15-18, não há intervenções farmacológicas demonstraram para melhorar o resultado na ICH e cuidados permanece em grande parte de suporte. As listas de possíveis terapias podem ser gerados pelas tecnologias de alto rendimento, como o trabalho transcriptomic e proteômica. Embora estas tecnologias continuam a avançar o nosso conhecimento de potenciais alvos terapêuticos, para frente e para trás tradução de alvos promissores podem ser melhor examinado através do uso de modelos pré-clínicos de relevância clínica 19-22. Tais modelos são úteis porque permitem a rápida movimentação de candidatos seleccionados, o exame dos mecanismos in vivo, a investigação barato de dosagem, a janela terapêutica, e outros parâmetros pertinentes ao desenvolvimento de ensaios clínicos 23-25. Embora existam vantagens óbvias em utilizar modelos pré-clínicos, a modelagem deve ocorrer no mais clinicamente relevante but sistema logisticamente viável disponível. Embora existam modelos para animais de ordem "superiores", como os primatas, o uso de ratos para modelar doenças humanas proporciona um baixo custo, alto rendimento e tecnologia poderosa para estudar mecanismos patológicos e efeitos terapêuticos. Incorporando sistemas transgênicas permite uma avaliação ainda mais robusto de vias mecanicistas e populações de células envolvidas.

Atualmente dois modelos murinos são de uso comum: sangue autólogo intrastriatal ou injeção de colagenase. Ambos os modelos são versátil e fácil de usar, em relação aos outros modelos de acidente vascular cerebral. Ambos os modelos podem induzir ICH em diferentes áreas do cérebro 26, permitindo a avaliação de respostas regionais; volume do hematoma pode ser controlada e alterada, permitindo a avaliação do ferimento leve, moderada e grave; e fisiologia clinicamente relevantes (por exemplo,., pressão, temperatura, etc) pode ser controlada. Finalmente, enquanto que cada modelo foi inicialmente desenvolvido emo rato, ambos desde já foram traduzidos para ratos para permitir o uso de sistemas de transgênicos 21,24,25,27. No entanto, cada modelo presta-se ao estudo de diferentes aspectos da ICH, uma vez que cada representa distintamente diferentes componentes do ICH. Sangue-injeção autóloga pode recriar a resposta do cérebro a exposição a sangue intraparenquimatosa. Assim, a massa inicial afetar e forças de cisalhamento, alterações inflamatórias leves, apoptose e reabsorção do sangue podem todos ser estudada 10,28. Além disso, as recentes modificações neste modelo resultaram na capacidade de imitar expansão hematoma 29,30. No entanto, este modelo não invoca o componente de lesão vascular e / ou expansão hematoma encontrado na doença humana. Em contraste, colagenase-injeção adiciona os elementos de ruptura vascular, expansão hematoma precoce e reforçada efeito neuroinflammatory. Embora as preocupações óbvias existem sobre contribuição artifactual de colagenase para o efeito inflamatório, há uma falta de difícil evidência para esta 31, e os nossos próprios dados (não publicados) sugerem que a colagenase isoladamente não induz uma resposta inflamatória significativa em cultura de células.

De um ponto de vista processual, ambos os modelos requer habilidade limitada com microcirurgia e, portanto, são facilmente aprendido, de modo a obter efeitos reprodutíveis. Armadilhas a evitar incluem: 1) invasão da dura ou a criação de uma lesão cerebral térmica quando a perfuração, 2) ou penetração do sistema ventricular com a inserção da agulha. Lesão Dural permite refluxo de injectant, e os resultados de injeção intraventricular em pouca ou nenhuma formação de hematoma intraparenquimatoso. Além disso, cuidados devem ser tomados após a retirada da agulha para não atrapalhar recém-formado / formando hematoma. A mortalidade é de se esperar em uma certa percentagem de ratos, mas está diretamente relacionada ao tamanho hematoma e grau de lesão desejada; assim, este resultado pode ser titulada em volume injectant / concentração.

Tal como acontece com todos os modelos, próprotocolos serão otimizados para uso por operadores específicos. Devido à variabilidade inerente a todos os sistemas in vivo, a experiência com um determinado modelo como um fator chave para o sucesso não pode ser exagerada. Características distintivas de um modelo, a experiência do operador com um determinado modelo, as métricas de resultados de interesse, e os fatores logísticos devem ser tidos em conta ao selecionar o melhor possível modelo experimental.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereotactic frame Stoelting Co. 51603
Probe holder with corner clamp Stoelting Co. 51631
Mini grinder Power Glide Model 60100002
0.5 μl syringe Microliter 86259 25 G needle
5 μl syringe Microliter 7637-01
30 G microliter syringe Microliter 7762-03
Syringe pump KD Scientific Model 100
Heat therapy water pump Gaymar Industries, Inc. Model# TP650
Circulating waterbed CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator Harvard Apparatus Model 683
Isoflurane vaporizer Drager Vapor 19.1
Air flowmeter Cole Parmer Model PMR1-010295
Induction chamber Self made
Otoscope Welch Allyn 22820
Intravenous catheter Becton-Dickinson 381534 20 G, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S Sigma C1889
Polyethylene tubing PE10 Becton-Dickinson 427401
27 G 1 1/4 inch needle Becton-Dickinson 305136
Surgical scissors Miltex 21-539
Forceps Miltex 17-307
Needle holder Boboz RS-7840
Monofilament suture Ethicon 8698 Size 5-0
Indicating controller YSI 73ATD

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References

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Lei, B., Sheng, H., Wang, H., Lascola, C. D., Warner, D. S., Laskowitz, D. T., James, M. L. Intrastriatal Injection of Autologous Blood or Clostridial Collagenase as Murine Models of Intracerebral Hemorrhage. J. Vis. Exp. (89), e51439, doi:10.3791/51439 (2014).

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