שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA
Summary
כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.
Abstract
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Introduction
מולקולה בודדת טכניקות (SM) פיתחו במידה רבה בשלושים השנים האחרונות להיענות לצורך להתגבר על חלק מהמגבלות של מדידות מסורתיות, בתפזורת פתרון 1-3. המניפולציה של מולקולות ביולוגיות בודדות יצרה הזדמנות כדי למדוד תכונות מכאניות של biopolymers 4 ולשלוט בפרמטרים מכאני חלבונים 5 ואינטראקציות החלבון-DNA 6,7 של. גילוי הקרינה SM, לעומת זאת, מייצג את הכלי תכליתי להפליא ללימוד פעילות חלבון במבחנת in vivo, שמוביל לאפשרות של איתור ומעקב אחר מולקולות בודדות בדייקנות ננומטר. באמצעות התאמה של מכשיר נקודת התפשטות פונקציה לתמונת SM, למעשה, אחד יכול להשיג לוקליזציה עם דיוק תלוי בעיקר על יחס אות לרעש (SNR) ולהגיע לגבול של כננומטר 8,9. מתודולוגיות אלה למצוא חזקותיישומים בחקר הדינמיקה של חלבוני מנוע, כמו גם של תהליכי דיפוזיה שבבסיס חיפוש יעד במחייב חלבוני DNA. היכולת של קביעת קבועי דיפוזיה כפונקציה של רצף DNA, זמן מגורים ביעד ומדידה מדויקת של אורך DNA חקר במהלך אירועי דיפוזיה חד ממדיים, מייצגת כלי רב עוצמה ללימוד דינמיקת אינטראקציה החלבון-DNA ולבירור של מנגנוני חיפוש יעד ספציפי.
לאחרונה, השילוב של שתי הטכניקות הללו יצר דור חדש של setups הניסיוני 10-14 המאפשר מניפולציה בו זמנית של מצע ביולוגי (למשל נימה אקטין או מולקולת DNA) ואיתור / לוקליזציה של אנזים שותף באינטראקציה (לדוגמא שרירן או חלבון קושר DNA). היתרונות של טכניקות אלה בעיקר לנוח על האפשרות של הפעלת שליטה מכאנית על פני הפולימר הלכוד, וכך ENAבלינג המחקר של דינמיקת אינטראקציה מול כוחות או מומנטים. כמו כן, המתודולוגיה מאפשרת מדידת תגובות ביוכימיות רחוקה מהמשטח, הימנעות אחת המגבלות העיקריות של שיטות קלאסיות SM, כלומר, (שקופית זכוכית או microspheres) את הצורך בקיבוע של המולקולות הנחקרות על משטח.
השילוב של שתי טכניקות מולקולות בודדות דורש התגברות על כמה קשיים טכניים, בעיקר כתוצאה מהדרישות של יציבות מכאנית ויחס אות לרעש הולם (במיוחד כאשר דורש לוקליזציה בדייקנות ננומטר) 15. במיוחד, כאשר צימוד גילוי הקרינה SM עם פינצטה אופטית, הפחתת הרעש וphotobleaching מלייזרי לכידת אינפרא אדום 16 והשליטה של מאגרים ביוכימי להרכבה של הקומפלקסים הביולוגיים וביצועים של המדידות הניסיוניות 11 הם בעלי חשיבות עליונה. כאן, אנו מתארים את השיטות לביצוע מוצלחמדידות בהתקנת לוקליזציה לכידה / SM הקרינה כפולה. המתודולוגיה מאוירת בדוגמא חלבון זה מדכא לקטוז (לאצי) שכותרתו fluorescently (עם Atto532) וזוהה כהוא נקשר למולקולת הדנ"א (לכודה בין שתי פינצטה אופטית) המכיל רצפי אצים ספציפיים מחייבים (כלומר, מפעילים) של. אנו מדגימים את היעילות של השיטה באיתור מחייב של לאצי לDNA ודיפוזיה לאורך קווי המתאר שלה בתהליך חיפוש היעד. השיטה ישימה לכל שילוב של רצף DNA וחלבון קושר DNA, כמו גם למערכות אחרות (microtubules או סיבי אקטין וחלבוני מנוע אינטראקציה איתם).
Protocol
Representative Results
Discussion
בעשור האחרון, טכניקות מניפולציה וההדמיה מולקולה בודדות שראו התקדמות גדולה במונחים של רזולוציה מרחב ובזמן. השילוב של טכניקות מניפולציה והדמיה הוא בבסיס של מכשירים רבי עוצמה שמאפשר כעת את השליטה בתנאים המכני של פולימר ביולוגי יחיד, כגון חוטי DNA, RNA או cytoskeletal, והלוקליזצ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Gijs Wuite, ארווין JG פיטרמן, ופיטר גרוס לעזרה עם מיקרופלואידיקה וAlessia Tempestini לעזרה עם הכנת מדגם. מחקר זה מומן על ידי תכנית האיחוד האירופי המסגרת השביעית (FP7 / 2007-2013) על פי הסכם מענק N ° 284,464 ומהמשרד האיטלקי לחינוך, אוניברסיטות והמחקר FIRB 2,011 RBAP11X42L006, Futuro בRicerca 2,013 RBFR13V4M2, ובמסגרת של פרויקט NANOMAX הדגל.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
| elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
| optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
| Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
| acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
| quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
| electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
| piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
| silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
| polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
| home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
| luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
| shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
| flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
| fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
| two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
| pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
| streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |
Referências
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
