Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA
Summary
Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos.
Abstract
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Introduction
Molécula única (SM) técnicas têm muito desenvolvido ao longo dos últimos 30 anos para responder à necessidade de superar algumas das limitações dos tradicionais, as medições da solução a granel 1-3. A manipulação de moléculas biológicas únicas criou a oportunidade para medir as propriedades mecânicas de biopolímeros 4 e controlar as propriedades mecânicas da proteína-proteína 5 e interacções proteína-ADN 6,7. Detecção de fluorescência SM, por outro lado, representa uma ferramenta extremamente versátil para estudar a actividade da proteína in vitro e in vivo, conduzindo a possibilidade de localizar e rastrear as moléculas individuais com uma precisão nanométrica. Através da montagem do instrumento de ponto de espalhamento de função para a imagem SM, na verdade, pode-se realizar com uma precisão de localização, dependendo principalmente da razão sinal-para-ruído (SNR) e atingir um limite de cerca de 8,9 um nanómetro. Estas metodologias encontrar poderosoaplicações no estudo da dinâmica das proteínas de motor, bem como dos processos de difusão subjacentes alvo em busca de proteínas de ligação de ADN. A capacidade de determinar constantes de difusão como uma função da sequência de DNA, o tempo de residência no alvo e medir com precisão o comprimento do DNA explorado durante os eventos de difusão unidimensional, representam uma ferramenta poderosa para o estudo da dinâmica de interacção proteína-ADN e para a investigação dos mecanismos de busca alvo específico.
Recentemente, a combinação destas duas técnicas produziu uma nova geração de montagens experimentais 10-14, permitindo a manipulação simultânea de um substrato biológico (por exemplo, um filamento de actina ou uma molécula de ADN) e detecção / localização de um parceiro de interacção enzima (por exemplo miosina ou uma proteína de ligação ao ADN). As vantagens destas técnicas descansar principalmente na possibilidade de se exercer um controlo mecânico sobre o polímero aprisionada, assim enaBling o estudo da dinâmica de interação contra forças ou torques. Além disso, a metodologia permite a medição de reacções bioquímicas longe da superfície, evitando uma das principais limitações dos métodos clássicos SM, isto é, a necessidade de imobilização das moléculas em estudo sobre uma superfície (lâmina de vidro ou microesferas).
A combinação de duas técnicas únicas moléculas requer superar várias dificuldades técnicas, principalmente decorrente das exigências de estabilidade mecânica e SNR adequada (principalmente quando houver a necessidade de localização com precisão nm) 15. Em particular, quando o acoplamento detecção de fluorescência SM com pinças ópticas, a redução do ruído e fotodegradação dos lasers infravermelhos armadilhas 16 eo controle de buffers bioquímicos para a montagem dos complexos biológicos e realização das medidas experimentais 11 são de suma importância. Aqui, descrevemos os métodos para a realização bem-sucedidamedições em uma configuração de localização trapping / SM fluorescência dupla. A metodologia é ilustrada com o exemplo da proteína do repressor da lactose (LacI), marcado por fluorescência (com Atto532) e detectada, uma vez que se liga a uma molécula de ADN (presa entre duas pinças ópticas), contendo sequências de ligação LacI específicos (isto é, os operadores). Nós demonstrar a eficácia do método em detectar a ligação de Lacl ao ADN e ao longo do seu contorno difusão no processo de busca de alvo. O método é aplicável a qualquer combinação de sequências de ADN e de proteína de ligação de ADN, bem como para outros sistemas de microtúbulos (ou os filamentos de actina e proteínas que interagem com eles a motor).
Protocol
Representative Results
Discussion
Na última década, as técnicas simples de manipulação de imagem e de moléculas houve um grande progresso em termos de resolução espacial e temporal. A combinação das técnicas de manipulação de imagem e está na base de poderosos instrumentos que agora permitem o controlo das condições mecânicas de um único polímero biológico, tal como ADN, ARN ou filamentos do citoesqueleto, a localização e simultânea de proteínas individuais de interagir com o mesmo polímero . Controlando as condições mecânica…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Gijs wuite, Erwin JG Peterman, e Peter Gross para ajudar com a microfluídica e Alessia Tempestini para obter ajuda com a preparação da amostra. Esta pesquisa foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de subvenção n ° 284464 e do Ministério da Educação italiano, Universidade e Pesquisa FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro em Ricerca 2013 RBFR13V4M2, e no âmbito da Projeto Nanomax Flagship.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
| elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
| optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
| Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
| acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
| quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
| electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
| piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
| silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
| polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
| home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
| luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
| shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
| flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
| fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
| two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
| pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
| streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |
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