La combinaison unique molécule manipulation et d'imagerie pour l'étude des interactions protéine-ADN
Summary
Nous décrivons ici l'instrumentation et des méthodes pour la détection de molécules de protéine unique marqués par fluorescence qui interagissent avec une molécule d'ADN unique suspendu entre deux microsphères optiquement piégés.
Abstract
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Introduction
Molécule unique (SM) techniques ont considérablement développé au cours des trente dernières années pour répondre à la nécessité de surmonter certaines des limites de mesures de la solution, en vrac traditionnels 1-3. La manipulation de molécules biologiques simples a créé la possibilité de mesurer les propriétés mécaniques des biopolymères 4 et de contrôler les paramètres mécaniques de protéine-protéine 5 et interactions protéine-ADN 6,7. SM détection de fluorescence, d'autre part, représente un outil très polyvalent pour l'étude de l'activité de la protéine in vitro et in vivo, ce qui conduit à la possibilité de localisation et de suivi de molécules individuelles avec une précision nanométrique. Par ajustement de l'appareil d'étalement de point de fonction-SM de l'image, en fait, on peut réaliser avec une précision de localisation en fonction principalement de rapport signal-sur-bruit (SNR) et d'atteindre une limite de l'ordre de 8,9 nanomètre. Ces méthodologies trouver puissantedes applications dans l'étude de la dynamique des protéines motrices, ainsi que des processus de diffusion qui sous-tendent la recherche de cible dans des protéines de liaison à l'ADN. La fonction de détermination de constantes de diffusion en fonction de la séquence d'ADN, le temps de séjour sur la cible et en mesurant la longueur de l'ADN étudié lors d'événements de diffusion à une dimension avec précision, représentent un outil puissant pour l'étude de la dynamique de l'interaction protéine-ADN et à l'enquête des mécanismes de recherche de cible spécifique.
Récemment, la combinaison de ces deux techniques a produit une nouvelle génération de dispositifs expérimentaux de 10 à 14 permettant la manipulation simultanée d'un substrat biologique (par exemple un filament d'actine ou une molécule d'ADN) et la détection / localisation d'un partenaire d'interaction enzyme (par exemple myosine ou d'une protéine de liaison à l'ADN). Les avantages de ces techniques reposent principalement sur la possibilité d'exercer un contrôle mécanique sur le polymère piégé, ainsi enabling l'étude de la dynamique d'interaction par rapport à des forces ou des couples. En outre, la méthode permet de mesurer les réactions biochimiques loin de la surface, en évitant l'une des principales limites des méthodes classiques SM, à savoir, la nécessité pour l'immobilisation des molécules à l'étude sur une surface (lame de verre ou microsphères).
La combinaison des deux techniques de molécules simples, il faut surmonter plusieurs difficultés techniques, principalement en raison des exigences de stabilité mécanique et SNR suffisant (en particulier en exigeant la localisation avec une précision nm) 15. En particulier, lors de l'accouplement détection par fluorescence SM avec des pincettes optiques, la réduction du bruit et photoblanchiment des lasers infrarouges piégeage 16 et le contrôle des tampons biochimiques pour l'assemblage des complexes biologiques et la performance des mesures expérimentales 11 sont d'une importance primordiale. Ici, nous décrivons les méthodes pour effectuer avec succèsmesures dans une configuration de localisation double piégeage / SM fluorescence. La méthodologie est illustrée par l'exemple de la protéine répresseur lactose (Lad) marqué par fluorescence (avec Atto532) et détecté comme il se lie à une molécule d'ADN (coincé entre deux pinces optiques) contenant des séquences spécifiques Laci liaison (c.-à-opérateurs). Nous démontrons l'efficacité de la méthode de détection de la liaison à l'ADN de LacI et la diffusion le long de son contour dans le processus de recherche de cible. La méthode est applicable à n'importe quelle combinaison de séquences d'ADN et de protéine de liaison à l'ADN, ainsi que pour d'autres systèmes (microtubules ou des filaments d'actine et de protéines interagissant avec les moteurs).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans la dernière décennie, les techniques de manipulation et d'imagerie de molécules simples ont vu de grands progrès en termes de résolution spatiale et temporelle. La combinaison des techniques de manipulation et d'imagerie est à la base de puissants outils qui permettent maintenant le contrôle de l'état mécanique d'un polymère biologique unique, tels que ADN, ARN ou du cytosquelette des filaments, et la localisation simultanée de protéines individuelles en interaction avec le même polymè…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Gijs Wuite, Erwin JG Peterman, et Peter Gross pour l'aide à la microfluidique et Alessia Tempestini de l'aide pour la préparation des échantillons. Cette recherche a été financée par le septième programme-cadre de l'Union européenne (7e PC / 2007-2013) sous convention de subvention n ° 284464 et par le ministère italien de l'éducation, Université et recherche FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro dans Ricerca 2013 RBFR13V4M2, et dans le cadre de la NANOMAX projet phare.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
| elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
| optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
| Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
| acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
| quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
| electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
| piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
| silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
| polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
| home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
| luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
| shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
| flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
| fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
| two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
| pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
| streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |
Referências
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