في الطريقة المختبر لمراقبة التفاعلات بوساطة selectin E-البروستاتا بين الخلايا السرطانية المنتشرة المستمدة من المرضى والبطانية الإنسان خلايا
Summary
يصف تقريرنا طريقة فريدة لتصور وتحليل التفاعلات CTC / المفوضية الأوروبية في سرطان البروستاتا في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية.
Abstract
ورم خبيث هو العملية التي الخلايا السرطانية من الورم تسليط intravasate الوعائية الدموية الابتدائي والجهاز الليمفاوي، وبالتالي، الوصول إلى يتسرب وتشكيل مكانة ثانوية. وتسرب الخلايا السرطانية من الدم الأوعية الدموية يمكن دراستها باستخدام الخلايا البطانية (ECS) والخلايا السرطانية التي تم الحصول عليها من خطوط مختلفة من الخلايا. وأجريت الدراسات الأولية باستخدام ظروف ثابتة ولكنها قد تم توثيقه جيدا أن ECS تتصرف بشكل مختلف في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. لذلك، يتم استخدامها حاليا مختلف التجمعات غرفة التدفق لدراسة التفاعلات الخلايا السرطانية مع ECS. المجالس الحالية غرفة التدفق تقديم نتائج قابلة للتكرار سواء باستخدام خطوط مختلفة من الخلايا أو السوائل في مختلف ظروف إجهاد القص. ومع ذلك، لمراقبة ودراسة التفاعلات مع خلايا نادرة مثل الخلايا السرطانية المنتشرة (التدرجي)، يطلب من بعض التغييرات التي ينبغي إدخالها على التجمع التقليدي غرفة التدفق. التدرجيهي السكان الخلية نادرة بين الملايين من خلايا الدم. وبالتالي، فمن الصعب الحصول على السكان نقية من التدرجي. تلوث التدرجي مع أنواع مختلفة من الخلايا التي توجد عادة في التداول أمر لا مفر منه باستخدام تقنيات تخصيب الحاضر أو استنزاف. في هذا التقرير، ونحن تصف طريقة فريدة من نوعها لتسمية تعميم خلايا سرطان البروستاتا fluorescently ودراسة تفاعلاتها مع ECS في نظام غرفة التدفق الذاتي تجميعها. هذه التقنية يمكن تطبيقها كذلك لمراقبة التفاعلات بين التدرجي البروستاتا وأي بروتين من الفائدة.
Introduction
ورم خبيث معقد عملية متعددة الخطوات التي لا تزال غير مفهومة تماما. وقد تبين محور يجند E-selectin/selectin للعب دورا هاما في الورم ورم خبيث من خلال تعزيز التفاعلات الأولية لاصقة بين بطانة الأوعية الدموية والخلايا السرطانية 1،2. البطانية (E)-selectin هو بروتين عبر الغشاء الذي أعرب عنه تنشيط الخلايا البطانية، في حين يتم التعبير عن مختلف يجند selectin E (ق) من قبل الخلايا السرطانية 3. وقد استخدمت العديد من النهج بنجاح في المختبر لنموذج التفاعلات يجند E-selectin/selectin بين الخلايا السرطانية والخلايا البطانية (ECS) 1. لدراسة هذه التفاعلات، يجري استخدام أنظمة مختلفة لمحاكاة غرفة تدفق الدم الأوعية الدموية. بين تدفق المجالس الغرفة، ويستخدم بشكل روتيني موازية لوحة غرفة تدفق (PPFC) بالتزامن مع ECS باعتباره محاكاة في المختبر في ظروف إجهاد القص الجسم الحي الطراز. في هذاتزرع الأسلوب، ECS على طبق 35 ملم وبعد تحقيق أحادي الطبقة، هي التي تعلق ECS إلى PPFC ويتم تنفيذ تجارب إجهاد القص القائمة.
ومع ذلك، PPFC وغيرها من النظم الحالية تقديم الكثير من القيود لدراسة التفاعلات لاصقة بين الخلايا السرطانية المنتشرة (التدرجي) المستمدة من المرضى وECS، في المقام الأول، لأن التدرجي هي نادرة السكان من الخلايا، تسلط من الورم الرئيسي، تعميم بين الملايين من خلايا الدم (1 CTC في 10 9 خلايا الدم) 4. وبالتالي، على عكس العرض غير محدود من خطوط الخلايا المستزرعة، التهم CTC منخفضة تؤدي إلى عدد قليل جدا ونادرة التفاعلات CTC / EC، تتطلب المناسبة عرض القناة تدفق لتسجيل لتحليل التفاعلات التشغيل. بالإضافة إلى ذلك، منذ المريض التدرجي المستمدة من السكان نجس، لذلك لا بد من وضع علامة تحديد لتتبع التدرجي بشكل خاص. لحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير طريقة جديدة لتحديد سرطان البروستاتا (PCA) CTخدمات العملاء من خلال الاستفادة من حقيقة أن جميع هذه التدرجي التعبير عن مستضد البروستات محددة غشاء (PSMA) على سطح الخلية الخاصة بهم 5،6. في هذا التقرير، استخدمنا خط الخلايا السرطانية في البروستاتا، MDA PCa2b (MDA)، للتدليل على فائدة محتملة من النظام الجديد لدينا لدراسة البروستاتا CTC التفاعل مع ECS، في نهاية المطاف إلى فهم آلية الانبثاث.
منهجيتنا يمكن تطبيقها على مختلف التجارب القائمة على محاكاة القص في نظام الأوعية الدموية فيفو 7-9. بالإضافة إلى دراسة التفاعلات PCA CTC / EC، ونظام غرفة التدفق الحالي يمكن تكييفها بسهولة لتحليل خلايا الدم المحيطية أو تفاعلات الخلايا السرطانية 'مع ECS. سهولة تفكيك وإعادة تجميع للغرفة التدفق، وهي شريحة مجهرية الثالث (0.1) (ويشار إليه فيما بعد ب شريحة مجهرية)، ويسمح زراعة ECS تحت نضح وتحفيز ECS مع السيتوكينات المختلفة للحث على العلاقات العامةotein التعبير. الى جانب ذلك، مثقف ECS، البروتينات المؤتلف مثل E-وف selectin يمكن أن تطلى على شريحة مجهرية والتفاعل مع الخلايا السرطانية يمكن ملاحظتها تحت ظروف تدفق الصفحي 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرجع ذلك إلى انخفاض عدد خلايا الدم بين التدرجي، فمن الصعب عزل التدرجي كما يبلغ عدد سكانها نقية من الخلايا. من أجل دراسة التفاعلات CTC / EC، السكان النادرة ونجس من التدرجي يطرح تحديين رئيسيين: أ) تحديد التدرجي بين خلايا الدم؛ ب) مراقبة التفاعلات CTC / EC.
<p class="jove_content" style=";t…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من وزارة الدفاع-البروستاتا برنامج أبحاث السرطان (W81XWH-12-1-0124)، U54CA143876 من المعهد الوطني للسرطان، وصندوق روبرت McCooey التناسلي الأورام البحوث. نود أن نشكر الدكتور Annarita لورنزو (قسم علم الأمراض) لتوفير الأجسام المضادة VE كادهيرين، والدكتور ماركو Seandel (قسم الجراحة) لتوفير HUVECs.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
Referências
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp–/rag2– mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
