In-vitro-Methode zur E-Selektin-vermittelte Interaktionen zwischen Prostata zirkulierenden Tumorzellen, abgeleitet von Patienten und humanen Endothelzellen beachten

Summary

Unser Bericht beschreibt eine einzigartige Methode zur Visualisierung und Analyse von CTC / EG Wechselwirkungen bei Prostatakrebs unter physiologischen Flussbedingungen.

Abstract

Metastasierung ist ein Prozess, in dem Tumorzellen zu vergießen aus dem Primärtumor intravasate Blut Gefäß-und Lymphsystem, damit, den Zugang zu extravasieren und bilden einen Sekundär Nische. Die Extravasation von Tumorzellen aus dem Blutgefäßsystem kann mit Endothelzellen (ECs) und Tumorzellen aus verschiedenen Zelllinien untersucht werden. Erste Studien wurden mit statischen Bedingungen durchgeführt, aber es ist gut dokumentiert, dass ECs anders unter physiologischen Flussbedingungen verhalten. Daher unterschiedlichen Strömungskammeranordnungen werden derzeit zum Studium Krebs-Zell-Interaktionen mit ECs verwendet. Aktuelle Durchflusskammer-Baugruppen bieten reproduzierbare Ergebnisse entweder mit verschiedenen Zelllinien oder Flüssigkeit bei unterschiedlichen Scherstressbedingungen. Jedoch zu beobachten und zu studieren Wechselwirkungen mit seltenen Zellen, wie zirkulierenden Tumorzellen (CTC), sind bestimmte Änderungen erforderlich, um das herkömmliche Strömungskammer-Anordnung hergestellt werden. CTCsind eine seltene Zellpopulation unter Millionen von Blutzellen. Folglich ist es schwierig, eine reine Population von CTC erhalten. Kontamination der CTC mit verschiedenen Arten von Zellen, die normalerweise im Blut gefundenen unvermeidlich mit vorliegenden Anreicherung oder Abreicherung Techniken. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir eine einzigartige Methode zur fluoreszenz Label zirkulierenden Prostatakrebszellen und studieren ihre Wechselwirkungen mit ECs in einer selbstorganisierten Flusskammer-System. Diese Technik kann weiter verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Prostata-CTC und jedes Protein von Interesse zu beobachten.

Introduction

Metastasierung ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, der kaum verstanden bleibt. Der Ligand E-selectin/selectin Achse ist gezeigt worden, eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung durch Förderung der Primär adhäsiven Wechselwirkungen zwischen dem vaskulären Endothel und Krebszellen ^1,2 spielen. Endothelzellen (E)-Selectin ist ein Transmembran-Protein von aktivierten Endothelzellen exprimiert wird, während die verschiedenen E-Selektin-Ligand (en) durch Tumorzellen ³ ausgedrückt. Zahlreiche in vitro-Ansätze wurden erfolgreich eingesetzt, um E-selectin/selectin Ligand-Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Endothelzellen (ECs) ¹ zu modellieren. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden verschiedene Durchflusskammer-Systeme eingesetzt, um Blutgefäßsystem zu simulieren. Unter Flusskammer-Einheiten wird Parallelplatten-Durchflusskammer (PPFC) in Verbindung mit ECs routinemäßig als in vitro-Modell simuliert in vivo Scherstressbedingungen eingesetzt. HierinVerfahren ECs auf einem 35-mm-Schale gezüchtet und nach Erreichen einer Monoschicht werden ECs zum PPFC befestigt und Scherspannung basierend Experimente durchgeführt werden.

, PPFC und anderen aktuellen Systemen präsentieren jedoch viele Einschränkungen zum Studium adhäsive Wechselwirkungen zwischen zirkulierenden Tumorzellen (CTC) von Patienten und ECs stammen, die vorwiegend, weil CTC sind eine seltene Population von Zellen, aus dem Primärtumor Schuppen, unter den Millionen von zirkulierenden Blutzellen (1 CTC pro 10 ⁹ Blutkörperchen) ^4. Daher, im Gegensatz zu unbegrenzten Vorrat an kultivierten Zelllinien, geringe CTC zählt zu sehr wenigen und seltenen CTC / EC-Interaktionen, erfordern richtige Strömung Kanalbreite, um die Interaktionen für die Wiedergabe Analyse aufzeichnen. Darüber hinaus, da Patienten abgeleitet CTC sind eine unreine Bevölkerung, also eine Identifikationsmarkierung ist erforderlich, um in bestimmten CTC verfolgen. Um dieses Problem zu lösen, ein neues Verfahren, um Prostatakrebs zu identifizieren (PCa) CT entwickelten wirCs unter Ausnutzung der Tatsache, daß praktisch alle diese CTC auszudrücken Prostata-spezifischen Membranantigen (PSMA) auf ihrer Zelloberfläche ^5,6. In diesem Bericht haben wir die Prostatakrebs-Zelllinie, MDA PCa2b (MDA), um den potentiellen Nutzen von unserem neuen System, um Prostatakrebs, CTC Wechselwirkungen mit ECs Studie zeigen, schließlich, um den Mechanismus der Metastasierung zu verstehen.

Unsere Methodik kann für verschiedene Scher basierte Experimente simuliert in vivo Gefäßsystem ^9.7 angewendet werden. Neben der Prüfung PCa CTC / EC-Interaktionen, konnte der Stromfluss-Kammer-System leicht für die Analyse von peripheren mononukleären Blutzellen oder Wechselwirkungen Tumorzellen 'mit ECs angepasst werden. Die Einfachheit der Demontage und Wiedermontage der Strömungskammer, ein Mikroobjekt III ^(0,1) (nachstehend als Mikroobjekt bezeichnet), ermöglicht die Kultivierung ECs unter Perfusion und Stimulieren ECs mit verschiedenen Zytokinen induzieren protein Ausdruck. Außerdem kultivierten Endothelzellen, rekombinante Proteine, wie E-und P-Selektin auf der Mikroobjekt und Interaktion mit Tumorzellen, beschichtet werden können, unter laminaren Strömungsbedingungen ¹⁰ beobachtet werden.

Protocol

1. Kultivierung HUVECs auf Mikroobjekttragerglaschen für Observing CTC-Endothel-Interaktionen Unter der Gewebekultur Kapuze, zuerst den Mikroobjekt spülen, Kanalbreite von 1 mm mit PBS. Sanft Beschichtung der Mikroobjekt mit 200 ul von 50 ug / ml Fibronektin (gelöst in PBS) unter Verwendung einer 1-ml-Luer-Lock-Spritze. Decken Sie die Mikroobjekt mit dem Deckel und halten Sie sie in der Gewebekultur Haube für 30 min. Langsame Abgabe der Flüssigkeit in den Mikroobjekt verhindert Blasenbildung im…

Representative Results

Figur 1 zeigt ein O / N-Kultur von einer Monoschicht von Endothelzellen auf der Mikroobjekt. Die Skalierungen auf Fig. 1A zeigt, dass 100% der Mikroobjekt sichtbar mit 5X Ziel, während 70% sichtbar mit einem 10X-Objektiv (Abbildung 1B). Für E-Selektin-vermittelte Wechselwirkungen werden die Zellen rollen an den Kanten nicht berücksichtigt, die mehr als 70% der Mikroobjekt verfügbar für Video-Aufnahme und-Wiedergabe Analyse macht. In unserer Erfahrung, zunächst die…

Discussion

Aufgrund der geringen Anzahl von CTC unter Blutzellen, ist es schwierig, CTC als reine Population von Zellen zu isolieren. Um CTC / EC-Interaktionen zu untersuchen, die seltene und unreine Bevölkerung von CTC stellt zwei großen Herausforderungen: a) Identifikation von CTC unter Blutzellen; b) Beobachtung der CTC / EC-Interaktionen.

Um die erste Einschränkung der Identifizierung Prostata CTC unter Blutzellen zu überwinden, nutzten wir die Tatsache, dass praktis…

Materials

Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Tygon	AAQ04103
Male luer adapter	GlycoTech	31-001
Female luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02