Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging
Summary
Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.
Abstract
Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung Licht verwendet wurde, um das Verhalten von Kleinstrukturen im motorischen Nervenenden der dünnen trans studieren abdominis des Strumpfbandnatter. Raw-Daten umfasst Zeitraffer-Sequenzen von 3D-z-Stacks. Jeder Stapel enthält 4-20 Bilder mit Epifluoreszenz Optik bei Brennebenen von 400-1,500 nm getrennt erworben. Schritte bei der Erfassung von Bildstapeln, wie beispielsweise die Einstellung des Fokus, Schalten der Anregungswellenlängen, und der Betrieb der Digitalkamera, so weit wie möglich, die Bildrate zu maximieren und Gewebeschäden durch Lichteinwirkung zu minimieren automatisiert. Nach der Übernahme wird ein Satz von Bildstapeln entfaltet, um räumliche Auflösung zu verbessern, umgerechnet auf die gewünschte 3D-Format und verwendet, um ein 4D "-Film," dass ist geeignet für eine Vielzahl von computerbasierten Analysen, je nach den experimentellen Daten gesucht erstellen. Eine Anwendung ist das Studium der Dynamik von zwei Klassen von Endosomen in den Nervenenden-macroendosomes gefunden (MES)und saure Endosomen (AES), deren Größen (200-800 nm für beide Typen) sind an oder nahe der Beugungsgrenze. Zugriff auf 3D-Informationen zu jedem Zeitpunkt bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Zeitraffer-Bildgebung. Insbesondere, Größe und Geschwindigkeit der Bewegung der Strukturen über die Zeit ohne Verlust von Schärfe quantifiziert werden. Beispiele für Daten aus 4D-Bildgebung zeigen, dass KU nähern sich der Plasmamembran und verschwinden, was darauf hindeutet, dass sie eher als exocytosed einfach vertikal bewegt weg von einer Ebene des Fokus. Auch offenbart ist putative Fusions MES und AES, durch Visualisierung der Überlappung zwischen den beiden Farbstoff-enthaltenden Strukturen, wie in je drei orthogonalen Projektionen angesehen.
Introduction
Zeitraffer-Bildgebung von lebenden Gewebe bietet visuelle Zugriff auf dynamische Struktur-Funktions-Beziehungen, die nicht in festen Zubereitungen oder leben in einem einzigen Punkt in der Zeit abgebildet geschätzt werden kann. Oft aber der Kompromiss für den Zugriff auf Zeitinformation ist eine Abnahme der optischen Auflösung. Hoher numerischer Apertur Öl-Immersionsobjektive sind unpraktisch in lebendem Gewebe wegen ihrer engen Bereich der Schwerpunkt, so dass Eintauchen in Wasser oder Trocken Ziele als die einzigen Alternativen. Darüber hinaus kann die erhöhte Auflösung durch konfokale Optik lieferte in einigen Lebens Vorbereitungen durch Phototoxizität von dem relativ hohen Niveau der Beleuchtung erforderlich 1,2 verwendet werden. Schließlich, während mehrere Echtzeit oder Zeitraffer-optische Techniken zur Verfügung, die eine verbesserte Auflösung bieten, ihre Anwendbarkeit auf Zubereitungen, für die Strukturen von Interesse nur wenige hundert Nanometer von der Ziel-1 positioniert werden beschränkt. Das beschriebene Verfahrenmacht von relativ kostengünstigen Ausrüstung ist vielseitig und bietet dennoch eine verbesserte Auflösung im Vergleich zu gebräuchlicheren Zeitraffertechniken. Es ist für den Einsatz in einzelnen Labors sowie Imaging-Einrichtungen vorgesehen.
Das Verfahren verwendet herkömmliche Epifluoreszenzmikroskopie, kombiniert mit einer empfindlichen digitalen Kamera und mit Hardware zur schnellen Sätze von Bildern erfassen mit leicht unterschiedlichen Brennebenen (Z-Stapel). Jedes Z-Stapel wird digital entfaltet, um die Auflösung zu erhöhen. Ein Merkmal der 3D Zeitraffer (4D)-Bildgebung ist präzise Verfolgung bewegter Organellen oder anderen Strukturen. Wenn richtig eingerichtet ist, nicht abgebildeten Strukturen nicht aus dem Fokus zu gehen, und die Bewegung in allen drei Richtungen beobachtet und quantifiziert werden. So ist es unmöglich für einen Bunt Struktur, um über eine oder mehrere Zeitraffer-Frames nur durch Driften über oder unter einem schmalen Brennebene verschwinden. Das Verfahren dient auch als empfindlich für die Beurteilung der Wechselwirkungen und mögliche fusion von kleinen Strukturen. Konventionelle Epifluoreszenz oder konfokale Bilder von Strukturen in der Nähe der Beugungsgrenze (ein paar hundert nm) nicht bestätigen Fusion zusammengeführt, auch wenn Bilder zeigen Überlappung der jeweiligen Etiketten 3. Fusion vorgeschlagen, aber es weiterhin möglich, dass die Objekte horizontal oder vertikal um eine Distanz, die unterhalb der Beugungsgrenze ist, abgetrennt. Drei-oder vierdimensionalen Abbildung, dagegen ermöglicht die Anzeige der Objekte in jeder der drei orthogonalen Richtungen. Das Aussehen der Fusion in allen drei Ansichten erhöht den Grad der Gewissheit. Und in einigen Lebensmittel, gerichtet oder Brownsche Bewegung der vermeintlich abgesichert Objekte ist ein weiterer Beweis, wenn beide Etiketten in der Zeit zusammen zu bewegen. Natürlich, wenn in der Nähe der Beugungsgrenze das Niveau der Sicherheit in anspruchsvollen Strukturen von Hintergrund oder zeigen, dass sie zwei Farbstoffe (Fusion) enthalten, ist nicht absolut. Ggf. spezielle Techniken, wie Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)4, sind besser geeignet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der wichtigste Aspekt der 4D-Bildgebung ist das Management von der Dauer und Intensität der Lichteinwirkung. Photobleichen abnimmt Bildsignal-zu-Rausch-Verhältnis und kann problematisch oder nicht in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Auswahl der Fluorophore sein. Unspezifische Schäden an lebendem Gewebe (Phototoxizität) auf Photobleaching bezogen, und kann manchmal mit Fluoreszenzsonden für die Zwecke 2,12 oder durch Prüfung der Morphologie mit geeigneten Hell Optik, wie Diff…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den US National Institutes of Health Grants NS-024572 (RSW) unterstützt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| SGC5 | Biotium [Hayward, CA] | 70057 | Final conc:10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen [Carlsbad, CA] | F35335 | Final conc:7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen [Carlsbad, CA] | L7528 | Final conc:0.2 mM |
| Solutions: | |||
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCL Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2. 5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 gm/50 mL) | ||
| Equipment: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments [Tonawanda, NY] | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics [Tucson, AZ] | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO] | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane [South Windsor, CT] | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe [San Jose, CA] | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health [Bethesda, MD] | Multiple plugins available;Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
Referências
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